JACS：通过试验方法揭示蛋白-配体中π-π作用力大小及功能

导读

近日，荷兰格罗宁根大学Dijkstra/Broos课题组的邵金凤博士在JACS杂志发表了标题为“The Role of Tryptophan in π Interactions in Proteins: An Experimental Approach”的文章，揭示色氨酸参与的π-π相互作用能够有效调节蛋白-配体亲和力，并首次获得其π作用力大小的试验数据。

正文

在蛋白质中，芳香族氨基酸的残基通过各种π相互作用在调节蛋白-配体结合过程中起到关键作用，例如π-π，cation-π，和CH-π等。虽然π相互作用很早就成为蛋白质功能研究的一个热点，但是π作用机制以及作用力大小尚不清楚。其中的一个主要原因在于试验技术方法有限。目前最长见的方法是通过突变芳香族氨基酸为非芳香族氨基酸，从而证实芳香环参与的相互作用的功能。但该方法最大的缺陷是，此种突变极有可能造成蛋白微环境改变从而导致无法正确分析π作用力。因此，本文作者通过氨基酸衍生物策略对芳香环π电子云强度进行微改变，从而来研究并定量分析蛋白质中的π作用力。

氨基酸衍生物策略通常包含三个部分，模型选择，衍生物选择及衍生物标记。首先，作者确定以LmrR蛋白作为模型来研究π-π相互作用机制及大小。LmrR蛋白以二聚体形式存在，并在二聚体interface区形成一个非特异性芳香小分子结合空间。X-ray晶体结构分析发现所有芳香小分子皆与色氨酸残基W96和W96’形成“三明治”形式的π-π相互作用（图1），促使LmrR成为该研究的首选模型。然后，作者选取了一系列含有氟原子取代基的色氨酸衍生物替换W96（图1）。氟原子具有很强的亲电属性，所以氟原子取代基能够达到改变π电子云强度的目的（图1）。针对衍生物标记部分，虽然有多种方法能将色氨基酸衍生物标记到蛋白质上，但是标记效率和蛋白产量都较低，从而限制了对π-π相互作用深入研究的可操作性。本文中，作者构建并优化了一个具有色氨酸缺陷型的乳酸菌蛋白表达系统。通过该系统，作者成功将上述含有氟原子取代基的色氨酸衍生物（图1）标记并替换到LmrR的W96位置上。质谱分析确定超过95%的W96被替换成相应的色氨酸衍生物。通过蛋白纯化技术, 作者最后可获得高达毫克数量级的LmrR蛋白，这为后续的各种生物化学和生物物理测试提供了足够的蛋白来源。

图1. 色氨酸衍生物和LmrR-Riboflavin中“三明治”形式的π-π相互作用（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

基于SPR技术（表面等离子共振技术），作者发现，随着色氨酸衍生物中氟原子取代基数量增加， 衍生物标记的LmrR蛋白与芳香小分子之间的亲和力（Kd）逐渐降低（图 2）。其中LmrR蛋白与Riboflavin（RBF）的亲和力降低了近70倍，表明该亲和力很大程度上取决于色氨酸芳香环上π电子云强度。作者还比较了不同温度对亲和力的影响，发现低温可提高亲和力～3.5倍，但是对自由能ΔG的影响却很小可忽略不计，表明由熵驱动的LmrR蛋白-芳香小分子的相互作用可能性较低。

图2. LmrR-ligand 亲和力随着氟原子取代数量的增加而降低（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

作者还进一步分析了LmrR蛋白与芳香小分子之间的结合与分离速率。结果发现所有衍生物标记的LmrR蛋白, 结合速率都接近扩散速度。但是，随着色氨酸衍生物中氟原子取代数量的增加，LmrR蛋白与芳香小分子之间的分离速率也随之提高。该结果再次证明，色氨酸芳香环上π电子云强度直接决定π-π作用力大小，从而影响LmrR蛋白与芳香小分子间的亲和力。

另外，作者还对所有色氨酸标记的LmrR蛋白进行了X-ray晶体结构分析，发现各种色氨酸衍生物均不影响LmrR蛋白整体结构以及结合位点的微结构。对LmrR-芳香小分子复合物晶体结构分析发现，所有芳香小分子依然以“三明治”形式的π-π相互作用结合到各种衍生物标记的LmrR二聚体上（图3）。所以，作者认为LmrR蛋白与芳香小分子之间的亲和力差异并不是因为各种衍生物导致LmrR蛋白结构改变所致。

图3. 各种色氨酸衍生物标记的LmrR蛋白与daunomycin小分子的X-ray晶体结构图（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者为了排除因蛋白类型而造成结果偏差的可能性，另选取了膜蛋白RibU作为另一个模型进行了π-π相互作用的研究。以类似的策略标记RibU蛋白，并通过荧光滴定技术测定了RibU与Riboflavin的亲和力。结果与LmrR模型一致，色氨酸芳香环上π电子云强度决定π-π作用力大小即蛋白-配体亲和力。

总结

综上所述，基于具有色氨酸缺陷型的乳酸菌蛋白表达系统，作者得以通过晶体结构首次展示了一系列由色氨酸衍生物标记的蛋白与配体复合物中的π-π相互作用。并通过对蛋白-配体亲和力分析，发现electrostaticinteraction是π-π作用力的一个重要组成部分。该研究将为药物设计，酶工程和蛋白设计等提供重要的理论依据。

文献详情：

Jinfeng Shao, Bastiaan P. Kuiper, Andy-Mark W. H. Thunnissen, Robbert H. Cool, Liang Zhou, Chenxi Huang, Bauke W. Dijkstra, and Jaap Broos*. The Role of Tryptophan in π Interactions in Proteins: An Experimental Approach. J. Am. Chem. Soc. 2022. https://doi.org/10.1021/jacs.2c04986