Nanodisc 在 GPCR 抗体研发中的应用

一、GPCR简介
GPCR（ Guanosine-binding Protein Coupled Receptor）中文名称为G蛋白偶联受体，是一种膜蛋白受体。GPCR作为细胞信号传导中的重要蛋白，其共同点是其蛋白体结构中都有七个跨膜结构。研究显示GPCR参与了很多细胞信号转导过程，当膜外的配体作用于该受体时，该受体的膜内部分与G蛋白发生结合，从而激活G蛋白。G蛋白可通过两种途径传递细胞外的信息：第一种方式是打开跨膜离子通道，让外界的离子进入；第二种方式是激活第二信使，如：cAMp、IP3/DAG等。简单来讲，GPCR能结合细胞周围环境中的化学物质并激活细胞内的一系列信号通路，引起细胞状态和功能的改变，同时参与多种生命活动以及内分泌与代谢等多种生理过程。从疾病方面来看，GPCR也与糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫疾病等重要疾病的发生、发展及治疗密切相关。
随着科研和生物医药领域发展的不断深入，GPCR的重要性也愈发显现，为了表彰在这一领域的贡献，2012年诺贝尔化学奖授予了两位美国科学家：罗伯特·莱夫科维茨（Robert J. Lefkowitz）和布莱恩·科比尔卡（Brian K. Kobilka），他们因“G蛋白偶联受体”研究领域的杰出贡献而获奖。从生物医疗领域的数据来看，大约40%的现代药物都以GPCR作为靶点。而至少有三分之一的小分子药物是GPCR的激活剂或者拮抗剂，在畅销药物排行中就有众多药物属于GPCR相关药物，比如：充血性心力衰竭药物Coreg、高血压药物Cozaar、乳腺癌药物Zoladex等，而还有更多这样的候选药物小分子在临床研发中。
针对GPCR的分类，主流有两种方法：一是A-F分类系统，面向所有生物体内的GPCR蛋白；第二种是将GPCR蛋白被分为Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2这5类。按照第二种分类标准来看，Rhodopsin受体类是GPCR家族中大的一类，而其下还分为多种亚家族。而整个Rhodopsin家族包含各种重要受体，如组胺受体、多巴胺受体、内皮素受体、催产素受体等。而其它类GPCR也包含众多受体种类，如钙敏感受体、甜味味觉受体等。
二、GPRC单抗药物开发
现阶段，作为开发药物靶点的受体约370个，分布于Glutamate、Rhodopsin、Adhesion、Secretin、Frizzled/TAS2 五大家族内。这些GPCR主要与生理代谢和疾病的形成有关，包括癌症、炎症、感染、代谢疾病等。药物作用于GPCR靶点，其主要的作用是阻断或激活胞外信号对靶点的激活，调控由靶点介导的胞内信号传导以及阻断病毒通过靶点侵入。作用于GPCR受体的药物可以是小分子药物或抗体类药物，相对于小分子药物，单克隆抗体药物治疗GPCR相关疾病拥有多方面优势。抗体在体内的清除率更低，作用时间更长；并且在给定剂量下，抗体的血浆浓度的个体差异更小。另一方面在药物开发方面，对于一些受体，小分子药物通过高通量筛选阶段的阳性率很低，成药难度大。此外单抗药物可以具有对受体更高的特异性以及避免一些小分子要会带来的副作用，如小分子药物可以穿过血脑屏障引起药副作用。现针对GPCR受体，用于治疗癌症、炎症和感染的很多抗体药物已经进入临床或上市，而更多的其它抗体药物正在加紧研发的过程中。
三、GPCR靶点的抗体药物研发中需要解决的抗体制备相关问题
现GPCR抗原主要形式有： GPCR全长蛋白、合成的GPCR胞外N端或loop区域、带有膜蛋白的细胞膜碎片、过表达GPCR的细胞、带有GPCR的脂质体、带有GPCR的类病毒颗粒等。各种方法各有特点，现就其存在的问题做一个简单描述。

全长GPCR作为抗原的优势在于比较纯净且相对接近天然构象，但困难在于获得了全长蛋白后其原包裹在细胞膜内的疏水域也暴露在外，这样容易筛到结合跨膜区的抗体。同时由于疏水域暴露在外，蛋白也容易发生聚集影响正确抗体的形成。对于合成胞外N端或loop区制作抗原的方法相对简单，但它们可能无法模拟蛋白的全部天然构象，表位容易遗漏和失真。带有膜蛋白的细胞膜碎片和过表达GPCR的细胞由于目标GPCR在整个膜上含量比例很低，因此会给筛选带来很高的背景从而影响结果。脂质体和类病毒颗粒作为GPCR蛋白的载体可以有效降低筛选背景，是现在效果较好的方法之一，但由于脂质体的不稳定性，导致在在应用时有无法忽视的局限。
筛选方法分为体内免疫和展示筛选。其中体内免疫法是常用和经典的方法之一，通过用抗原免疫动物，然后从动物的脾脏中分离B细胞，制备杂交瘤，筛选单克隆抗体。而是否能更好的得到产生目标抗体的B细胞，用与引起免疫反应的抗原的稳定性、单一性、期望产生抗体结合的位点是否外露、不期望产生抗体结合的部分是否被包裹都显得尤为重要。
四、Nanodisc用于GPCR抗体的制备
Nanodiscs是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构。通过这种特殊的结构，GPCR可以整合到Nanodiscs中，保持其生物学活性，为GPCG的研究提供了有力的技术支持。膜支架蛋白(MSPs)是载脂蛋白(apo) A-I的缩减版，它们包绕着脂质双分子层从而形成圆盘状的结构，即纳米盘。其包含一个朝向内部脂层的疏水面和朝外的亲水面。这一结构使得Nanodiscs在水溶液中具有很高的溶解度，同时具有非常高的稳定性。通过Nanodisc包裹，纯化后的GPCG在保持空间结构稳定和活性的同时，也将不期望暴露的跨膜域如同在细胞膜内一样包埋在磷脂双分子层内部。

图2：膜蛋白组装到Nanodiscs的原理图。绿色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白(来源Cube Biotech)
五、Nanodisc包裹纯化后的GPCR用于抗原制备有众多优势
1、Nanodisc可以为GPCR提供一个类似细胞膜双分子层的结构，使其原有的结构和功能可以被保护。同时跨膜区域和膜外区域也能和在细胞膜上一致，避免了直接使用纯GPCR作为抗体会产生的结合跨膜区域的抗体形成的问题。同时，通过Nanodisc包裹的GPCR作为抗原也避免的直接使用细胞膜碎片作为抗体会引起高背景等问题，使后续筛选难度大大降低。
2、Nanodisc 包裹完整GPCR，不会有使用合成胞外N端或loop区制作抗原造成的表位容易遗漏和失真的问题。
3、Nanodisc通过膜支架蛋白固定磷脂，使其结构非常稳定，从而避免了使用脂质体包裹GPCR作为抗原的不稳定和易破裂等问题。
4、为了针对不同的应用要求，膜支架蛋白可以是人源化或鼠源化的，如此可以避免用鼠作为免疫动物，人源化的膜支架蛋白会引起不必要的免疫反应。
六、将膜蛋白组装到Nanodiscs中的两种方法
方法1：组装溶解在去污剂中的膜蛋白
在去污剂存在条件下将GPCR纯化，然后再添加MSPs和磷脂。含有膜蛋白的Nanodiscs能够自发地组装，在去除掉表面活性剂后可以通过凝胶过滤（排阻层析）等方式来纯化。
方法2：Nanodiscs与无细胞表达体系相结合
另一个方法是，GPCR在无细胞表达体系中被表达，通过加入已经和GPCR结合预先组装的Nanodiscs，膜蛋白能通过无细胞表达系统表达出来。

图3：膜蛋白与Nanodisc的两种组装机制(图片来源Cube Biotech官方网站)

左图：膜蛋白（橙色）溶解在去污剂（深灰色）中并与冻干的MSP（绿色）和磷脂（浅灰）混合。然后去除去污剂，形成蛋白-Nanodisc复合物。右图：预组装了MSP与磷脂的Nanodiscs加入到无细胞反应液（cell-free expression systems）中，新生的GPCR能够自发地组装到Nanodiscs中。
GPCR作为药物靶点在未来有着巨大的潜力，随着单克隆抗体研发相关技术和产品的丰富，在可见的未来将会有越来越多针对各类疾病的优秀药物产品推向市场！
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20. 基于GPCR家族的抗体研发现状和展望-公众号生物制药小编文章

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23. 诺贝尔化学奖:G蛋白偶联受体-生物通文

24. 生物制药小编

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