Angew：siRNA点击化学修饰抑制新冠病毒复制

‍论坛嘉宾包括周其林院士/冯小明院士/11位知名教授‍

导读

近日，德国慕尼黑大学Thomas Carell与Oliver T. Keppler教授合作，在Angew上发表了题为“Suppression of SARS-CoV-2 Replication with Stabilized and Click-Chemistry modified siRNAs”的研究文章，借助修饰的小干扰RNA（siRNA）抑制多种新冠病毒突变体的复制。通过优化siRNA可将SARS-CoV-2病毒载量以及其诱导的毒性降低5个数量级。同时采用ACE2结合肽缀合siRNA可有效抑制3D肺粘液纤毛肺微组织中病毒复制以及病毒导致的细胞凋亡。

研究背景

小干扰RNA（简称siRNA），又称短干扰核糖核酸，是20至25个核苷酸碱基对组成的双链RNA，目前主要用于专一性干扰mRNA，从而下调目的基因表达。siRNA最早是由英国David Baulcombe研究团队发现，其参与植物后转录基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS），相关工作发表于Science （286（5441）：950–952）。

目前各国研究人员主要借助化学修饰的mRNA疫苗来遏制COVID-19大面积传播。但是由S蛋白突变引起的SARS-CoV-2的突变体导致疫苗的功效大打折扣，因此迫切需要开发可针对突变体调控的新冠疫苗或者其他治疗策略。SARS-CoV-2是种正链单链RNA病毒，通过人血管紧张素转换酶2（hACE2）受体人进入宿主细胞。此外，病毒基因组RNA通过亚基因组mRNA的复制，实现病毒蛋白的生物合成。在病毒复制过程中，可产生两种单链RNA，基因组RNA以及亚基因组RNA。其中siRNA可同时靶向这两种mRNA，实现双重基因沉默。因此，基于siRNA的病毒mRNA降解可根据突变体的基因序列做出快速调整。

关键合成步骤

图1. 构造靶向SARS-CoV-2病毒siRNA（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者通过分析病毒的基因结构，设计了一系列SARS-CoV-2 siRNA（L1, R-2 to R-5, S-6 to S-9），可与不同病毒RNA靶区互补。所有siRNA的3'末端包含两个2'-脱氧胸苷核苷酸，可有效抵抗外切核酸酶降解。作者针对RNA聚合酶（RdRp、Nsp12）、S蛋白和5'-前导序列（L）设计了多种siRNA（图 1a）。其中非靶向siRNA（Ctrl-10）作为阴性对照。

基因沉默效率分析

作者首先通过双荧光素酶报告基因分析了人肺腺癌细胞系A549的siRNA基因沉默效率。A549通过采用海肾萤光素酶和萤火虫萤光素酶质粒进行转染，将海肾荧光素酶报告基因与SARS-CoV-2的siRNA靶基因组序列融合。因此，siRNA可有效靶向A549细胞并导致海肾荧光素酶转录物降解，从而降低蛋白质表达。相对于萤火虫萤光素酶活性对海肾萤光素酶活性进行量化，萤火虫萤光素酶活性作为质内编码报告基因进行标准化以平衡转染效率的差异。借助该测定法，作者检测到与乱序序列的非靶向对照 siRNA相比，siRNA L-1（目标区域：L）、R-2和R-5（目标区域：RdRp、Nsp12）和S-6（目标区域：S）的基因沉默效率在80%和92%之间（图 1b）。

图2. 靶向SARS-CoV-2病毒siRNA结构修饰（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

作者进一步检测了这四种最具潜力的siRNA的抗病毒效率。采用经过B.3穿山甲谱系SARS-CoV-2分离物感染的具有复制能力的Vero-E6细胞作为检测模型。同时使用lipofection作为转染siRNA试剂，分析其在转染前一小时和转染后一小时的抗病毒能力。通过检测转染后三天斑块形成单元（PFU）来量化最终的效率， 结果显示，siRNAs R-2和S-6具有高抗SARS-CoV-2活性 。相反，siRNAs R-5 几乎没有效果（图 1c-d）。作者进一步分析极有可能是SARS-CoV-2 RNA在靶点区域具有一个较大的发卡结构，可能干扰siRNA-RISC复合物的作用。

图3.RBD结合肽缀合siRNA抑制3D肺粘液纤毛肺微组织中病毒复制以及病毒导致的细胞凋亡（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

目前所有临床使用的基于siRNA基因治疗剂皆具有核苷修饰，通过硫代磷酸酯旁位2'OMe以及2'F进行取代，从而增加对人血清核酸内切酶抗性。因此，作者进一步制备了完全修饰的siRNA S-6fm（图 2b）。然而结果显示，虽然完全修饰的siRNA具有更高稳定性，但是同时其抗病毒能力也降低40%，部分修饰的siRNA S-6m具有更高的稳定性同时保留了抗病毒效率，因此在接下来研究中，作者选择了部分修饰siRNA S-6m（图 2c-d）。RNA治疗剂和疫苗通常使用基于阳离子脂质或聚合物的纳米颗粒递送到细胞和组织中，但递送剂通常具有副作用。同时几乎不可能递送至患者SARS-CoV-2感染上皮细胞。因此，为研究递送至上皮细胞，作者评估了siRNA是否可以预防SARS-人类3D粘液纤毛肺EpiAirwayTM微组织中的CoV-2感染和病毒诱导的细胞死亡。这些微组织来源于源支气管分化的气道上皮细胞。

作者借助Cu(I)催化的点击化学（炔烃与叠氮）制备了嵌合siRNA-配体缀合物（siRNA化学修饰配体），从而摆脱对递送剂的依赖（图 3a）。这种方法类似于临床上批准的肝靶向siRNA N-乙酰半乳糖胺修饰。结果显示，siRNA-配体缀合物（hACE2受体）的效果并没有阳离子脂质Lipofection明显（图 3b）。为进一步验证，作者重新研究了使用siRNA S-6m和 lipofectamine转染的病毒滴定实验。虽然细胞活力数据表明在感染后使用siRNA S-6m 72小时完全抑制病毒复制（图 4a），但相比之下，残留的病毒材料仍可通过RT-qPCR（图 4b）检测到，S-6m和Ctrl.-10之间Ct 值差异较小。为了排除引物特异性伪影，作者使用RdRp、E和M基因靶向引物进行了额外的PCR定量，并观察到S-6m的影响实际上对S基因最强（图 4c）。

图4. RBD结合肽缀合siRNA病毒复制（图片来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

总结

与小分子相比，siRNA可同时靶向多个病毒位点，从而降低逃逸变异的风险。本文中，作者通过构建2'-OMe 修饰的siRNA兼顾血清稳定性以及抗病毒活性。进一步借助点击化学对siRNA 5'端进行配体修饰（hACE2为受体），实现细胞类型特异性靶向的有效抗病毒，有效抑制3D肺粘液纤毛肺微组织中病毒复制以及病毒导致的细胞凋亡。

图5. Thomas Carell教授（图片来源：carellgroup.de）

Thomas Carell教授以合成有机化学为基础，致力于核酸分子结构解析以及化学修饰。侧重于主观调控/表观遗传修饰有害的DNA。借助点击化学合成修饰DNA、构建高灵敏诊断探针。相关工作发表于Science, Nature, Cell等顶刊。2004年，获得德国研究领域的最高荣誉——德意志研究中心的戈特弗里德·威廉·莱布尼茨奖。2008年，因在DNA修复系统方面工作获得Otto Bayer Prize。2008年，成为德国科学院Leopoldina成员。

课题组网页：https://www.carellgroup.de/

图6. Oliver T. Keppler教授（图片来源：genzentrum.uni-muenchen）

Oliver T. Keppler教授研究领域涉及分子逆转录病毒学，侧重于HIV发病机制研究、HIV感染新辅助因子鉴定、HIV感染物种特异性屏障以及适应性和内在免疫调节剂研究。同时在肿瘤化疗耐药领域，研究SAMHD1酶的作用以及克服肿瘤对化疗耐药的新策略。相关工作发表于Nat Med., Nat Methods., Nat Commun.等顶刊。2007获得德国传染病学会艾滋病研究奖。2022年，获得巴伐利亚功绩勋章。

课题组网页： https://www.genzentrum.uni-muenchen.de/research-groups/keppler/index.html

文献详情：

Traube, F..R., Stern, M., Tölke, A..J., Rudelius, M., Mejías-Pérez, E., Raddaoui, N., Kümmerer, B..M., Douat, C., Streshnev, F., Albanese, M., Wratil, P..R., Gärtner, Y..V., Nainytė, M., Giorgio, G., Michalakis, S., Schneider, S., Streeck, H., Müller, M., Keppler, O..T. and Carell, T. (2022), Suppression of SARS-CoV-2 Replication with Stabilized and Click-Chemistry Modified siRNAs. Angew. Chem. Int. Ed.. Accepted Author Manuscript. https://doi.org/10.1002/anie.202204556