动静脉内皮细胞的体外分化证实尼帕病毒和亨德拉病毒的动脉嗜性

撰文 | Qi

尼帕病毒和亨德拉病毒分别能在亚洲和澳洲引起59%和57%的致死率，它们能引起严重的多器官血管炎，并最终导致呼吸和神经功能衰竭，由于BSL4（生物安全4级）实验的限制和不完备的实验系统，使得确认这些病毒的靶细胞及对它们的影响变得困难。据报道动脉和静脉内皮细胞（Endothelial cells,EC）都可以在体外被尼帕和亨德拉病毒感染，但需要注意的是，从动静脉分离的ECs在体外会迅速抛弃其原有动静脉亚型特性，因而病毒对特定ECs亚型的嗜性及影响的研究受到了限制。

人类多能干细胞（hPSCs，包括胚胎和诱导多能干细胞）向特定细胞类型的分化正在迅速推进，但想要产生所需细胞亚型的纯群体仍然具有挑战性，必须严格控制分化为亚型的分支谱系选择和控制其命运的每一步细胞外信号。有研究指出VEGF和NOTCH能够指定体内ECs如何向动静脉亚型发展【1, 2】，然而，在体外生成动脉或静脉ECs的挑战性提示目前对于这些亚型发展历程的理解仍不完全，以及可能存在使它们各自分化的额外信号。

2022年6月22日，来自斯坦福大学的Kyle M. Loh团队等多个团队在Cell杂志上合作发表了一篇题为Generating human artery and vein cells from pluripotent stem cells highlights the arterial tropism of Nipah and Hendra viruses的文章，他们揭示了hPSCs分化为动静脉ECs的每一步所需的额外信号，以及必须同时抑制以防止出现非目标细胞类型的胞外信号，在hPSCs分化的3-4天内获得了>90%的纯人类动脉或静脉ECs群，发现尼帕病毒和亨德拉病毒优先感染表达更高水平病毒进入受体的动脉，被感染的动脉细胞融合成含有多达23个细胞核的合胞体并迅速死亡。两种病毒在很大程度上能避开先天免疫检测，最低限度地引发干扰素信号传导。总之，这项工作有效地生成动静脉内皮细胞，并揭示尼帕病毒和亨德拉病毒的动脉嗜性和细胞效应。

研究人员首先按照如图1所示的流程，试图模拟小鼠胚胎发育将hPSCs逐渐分化为原条、侧中胚层和动静脉。简单来说，激活TGF-β（指向动脉）和VEGF（指定 ECs），同时阻断BMP、WNT和PI3K 24小时，将D2的外侧中胚层分化为D3动脉ECs，同时抑制不需要的分化为心脏或静脉谱系。需要注意的是，TGFβ必须经历动态激活（D1被激活以诱导原条、D2被抑制以诱导外侧中胚层、D3被重新激活以诱导动脉），否则也会诱导静脉标志物NR2F2，因而hPSCs分化的3天内即生成了纯度>90%的SOX17+CD144+动脉ECs，并通过scRNA-seq对分化效率进行验证。在定义了动脉指定信号后，研究人员想了解哪些信号可以诱导静脉ECs。与动脉类似，也需要以时间动态方式操纵VEGF/ERK和WNT，同时抑制动脉特异性信号，才能将hPSCs分化为静脉ECs，最终可有效生成纯度>88%的NR2F2+CD144+静脉ECs。

hPSCs衍生的动脉和静脉ECs之间存在明显的包括已知的动静脉亚型标志物在内的转录组差异。通过与纤维蛋白水凝胶内的间充质细胞共培养1周，或将两种ECs移植到免疫缺陷小鼠1个月后，均能在体内外形成血管网络，并能执行各自标志性的ECs功能，比如对剪切应力的反应、出芽能力、对炎症的反应以及向趋化因子的迁移。举例来说，暴露于流体流动24小时后，剪切应力优先上调动脉 ECs中的AQP1和CX37，说明两种ECs亚型对剪切应力的不同转录反应。就炎症反应而言，用TNF-α处理4小时后，免疫细胞粘附分子VCAM1和E-SELECTIN在动脉ECs中特异性上调等。这些证据指出hPSCs衍生的动静脉ECs表现出重要的转录和功能差异，表明它们已经获得了不同的亚型特征。

接下来，研究人员应用hPSCs衍生的动静脉ECs来研究尼帕和亨德拉病毒的嗜性。在感染动脉ECs后两种病毒诱导它们融合成多核合胞体，包括每个细胞含有多达23个细胞核的巨大合胞体（图2），而静脉ECs融合较少（44.5% vs 1.3%），且尼帕病毒在感染后24小时内将动脉ECs数量减少了71.0%，而静脉ECs受到的影响明显较小，说明两种病毒的动脉嗜性。那么造成这种选择性的原因是什么呢？EFNB2是这些病毒的已知受体，在动脉ECs中表达更高【5, 6】。hPSCs衍生的ECs真实再现了EFNB2表达的动静脉差异。动脉相较于静脉而言，EFNB2蛋白和mRNA水平分别高出8.8倍和10.4倍。如果敲除EFNB2基因则会导致动脉ECs中的两种病毒复制大幅度减少430.3至6289.2倍，但不会影响无关的水泡性口炎病毒进入，说明EFNB2对于尼帕和亨德拉病毒的进入是“必要的”，补充了长期以来的研究结果。

图2. 在感染病毒后hPSCs衍生的动静脉ECs中的合胞体。

最后，研究人员用尼帕病毒、亨德拉病毒以及相关的非致病性副粘病毒仙台病毒感染动脉ECs，并在感染后5、10或15小时进行RNA-seq分析。15小时后，尼帕病毒占据转录组的17.2%，亨德拉占6.4%，仙台病毒相对有限。需要注意的是，尽管两种病毒能引起显著的病毒复制和细胞融合，但它们对宿主基因表达水平的影响非常小，以至于在抑制抗病毒和炎症基因的诱导方面非常有效。相反，仙台病毒尽管病毒载量低，但在感染24小时候诱导IFNβ分泌升高100.8倍。

总的来说，这项工作绘制了驱动或抑制动静脉ECs亚型每一步分化的时间动态细胞外信号，精确诱导两种亚型产生，并利用它们解释了尼帕病毒和亨德拉病毒的靶向性和影响。“按需”高效、快速地生成动脉和静脉ECs的能力有助于为再生医学、组织工程和人类血管疾病建模。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.05.024

制版人：十一

参考文献

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2. Ditadi, A., Sturgeon, C.M., Tober, J., Awong, G., Kennedy, M., Yzaguirre, A.D., Azzola, L., Ng, E.S., Stanley, E.G., French, D.L., et al. (2015). Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.Nat. Cell Biol.17, 580–591.

3. Hong, C.C., Peterson, Q.P., Hong, J.Y., and Peterson, R.T. (2006). Artery/vein specification is governed by opposing phosphatidylinositol-3 kinase and MAP kinase/ERK signaling.Curr. Biol. 16, 1366–1372.

4. Park, M.A., Kumar, A., Jung, H.S., Uenishi, G., Moskvin, O.V., Thomson, J.A., and Slukvin, I.I. (2018). Activation of the arterial program drives development of definitive hemogenic endothelium with lymphoid potential.Cell Rep. 23, 2467–2481.

5. Bonaparte, M.I., Dimitrov, A.S., Bossart, K.N., Crameri, G., Mungall, B.A., Bishop, K.A., Choudhry, V., Dimitrov, D.S., Wang, L.-F., Eaton, B.T., et al. (2005). Ephrin-B2 ligand is a functional receptor for Hendra virus and Nipah virus.Proc. Natl. Acad. Sci. USA102, 10652–10657.

6. Chong, D.C., Koo, Y., Xu, K., Fu, S., and Cleaver, O. (2011). Stepwise arteriovenous fate acquisition during mammalian vasculogenesis.Dev. Dyn.240, 2153–2165.

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