G1期环挤压的“绊脚石”——MCM复合物

撰文 | 言笑

环挤压模型（loop extrusion model）是近几年提出的用于解释染色质结构域形成的理论模型，该模型认为粘合素（cohesin）沿着染色质进行挤压，形成逐渐增大的环状结构，直到cohesin遇到障碍和/或被Wapl释放而停滞【1-3】。在脊椎动物中，loop extrusion的主要障碍是CTCF（CCCTC binding factor, CTCF），CTCF和cohesin一起划定结构域的边界（domain boundary）。通过loop extrusion产生的结构可以通过高通量染色质构象捕获技术（a high-throughput, genome-wide version of chromosome conformation capture: Hi-C）进行检测【4】。然而，Loop extrusion机器在染色质上还会遇到其他障碍，如核小体和其他蛋白质复合物，那么这些DNA结合蛋白是否也会影响真核生物的三维基因组结构尚不清楚。

小染色体维持（minichromosome maintenance,MCM）复合物是一种丰富的大分子机器，对于真核生物和古菌中的DNA复制至关重要【5】。MCM2-MCM7复合物（以下简称MCM）由起始识别复合物（origin recognition complex, ORC）、Cdc6和Cdt1在复制起始处加载（loading），进而在有丝分裂和G1期形成复制前复合物（pre-replication complex）【6】。头对头双 MCM 六聚体捕获双链 DNA并作为无催化活性的解旋酶，直到 DNA 复制开始【7】。值得注意的是，染色质上加载的MCM比S期所需的多10-100倍，这被称为“MCM paradox”【8】。多余的MCM已被证明可以通过降低复制叉速度来防止DNA断裂，但它们在G1期是否有任何功能后果尚不清楚。

近日，来自奥地利维也纳生物中心的Kikuë Tachibana团队、德国马克斯·普朗克生物化学研究所（MPIB）的Karl E. Duderstadt团队与美国麻省理工学院（MIT）的Leonid A. Mirny团队合作在Nature杂志上在线发表了题为MCM complexes are barriers that restrict cohesin-mediated loop extrusion的文章，揭示MCM复合物是G1期中限制cohesin介导的loop extrusion的屏障，并以这种方式影响基因组结构。

该研究中，作者使用卵母细胞到受精卵的转变（oocyte-to-zygote transition）来研究MCM缺失是否会影响loop extrusion。为了获得缺乏染色质结合的MCMs的受精卵，作者干扰了Cdt1介导的loading途径。在小鼠卵母细胞中注射GFP或GFP标记的geminin (L26A) mRNA【9】。与注射GFP相比，在表达geminin (L26A) 的受精卵中，很少或没有检测到染色质结合的MCM和EdU的掺入，证明 MCM loading被有效抑制（MCM丢失）。使用这种方法，作者构建了MCM丢失和对照受精卵，分离了G1期的母源和父源原核，并进行了snHi-C（single-nucleus Hi-C）。数据显示，MCM丢失导致母源染色质中的峰值（peaks）和拓扑结构域（topologically associated domains, TADs）增加，父源染色质增加更强。MCM 丢失后peaks强度的增加可以反映更高的 CTCF 占用率，但这不能解释体外观察到的屏障效应（barrier effect）。

为了确定MCM如何影响染色质组织，作者检测了接触概率Pc(s)。MCM丢失对低于1 Mb的Pc(s)曲线几乎没有影响，表明挤压环的平均尺寸不受影响。CTCF缺失对peaks的效应【4】与MCM缺失的效果相反，那么CTCF 和 MCM 是否一起确定了peaks和 TADs边界绝缘的强度。结果显示，CTCF敲低导致TADs边界绝缘减弱，并且没有显著改变低于1 Mb的Pc(s)曲线。CTCF敲低后引起的TADs缺乏与MCMs无关，表明MCM对于位置特异性的边界建立没有指导功能。随后，作者考虑了另一种可能性，即MCM通过与Wapl一起从染色质中释放cohesin来影响环状结构。这基于wapl敲除和MCM丢失后对Hi-C peaks和TADs强度的影响类似【10】。数据显示，MCM丢失和Wapl敲除的组合显著提高了peaks和TADs强度，表明他们通过不同的机制发挥功能。MCM和Wapl的联合丢失增加了TAD边界绝缘强度，表明当cohesin停留时间增加时，MCMs也会限制loop extrusion。

作者将MCMs作为随机定位的渗透挤压屏障引入到环挤压的聚合物模型中。在该模型中，Cohesin挤出环，在遇到诸如 CTCF位点、MCM或其他粘着蛋白等障碍物时，可以阻止环挤出。Cohesins可以绕过一些 CTCF 和 MCM，绕过 MCM 或 CTCF位点的选择是随机的并且随时间变化（图1）。聚合物模拟确定了参数，包括MCMs的渗透率，这样可以定量地再现peaks强度和父染色质Pc(s)曲线。MCM的半渗透率可以解释在G1期存在MCMs的情况下CTCF-anchored loops是如何产生的。作者认为该模型为MCM在不强烈影响挤压环平均尺寸的情况下降低CTCF-CTCF peak强度的看似矛盾的能力提供了一个合理的解释。如果cohesin将一对CTCFs之间的所有染色质挤出成环，则会出现峰值。一个随机屏障可防止cohesin挤出 CTCF 之间的所有染色质，留下未挤出的间隙。然而，如果屏障具有足够的渗透性或稀疏性，则随机屏障对环的平均大小的影响是微不足道的。

图1. Cohesin与CTCF和MCM相互作用的loop extrusion定量模型

对 MCM 丢失对基因组结构的影响的最简洁的解释是 MCM 通过形成随机定位的屏障来干扰loop extrusion。作者建立了一种MCM“路障测定”方法（roadblock assay），用于在单分子水平上实时监测cohesin-MCM相互作用，检测cohesin的被动易位。Cohesin与MCM相遇的直接可视化证实了cohesin易位的限制。在220-s成像窗口期间，cohesin分子的亚群甚至一次也无法通过origins，表明MCM是cohesin易位的物理屏障。作者还检测了哺乳动物 MCM 是否比酵母 MCM 对cohesin易位具有更强的屏障作用。与酵母Mcm3不同，人MCM3含有19个氨基酸无序区域，该区域含有YDF基序，足以在体外结合STAG2-SCC1 cohesin。相同的基序介导CTCF和STAG2-SCC1之间的相互作用。与MCM相比，cohesin绕过MCM-YDF的频率略低，这表明其阻隔强度与酵母MCM相当。值得注意的是，在遇到MCM-YDF时cohesin频繁暂停，暂停平均占总观察时间的43%。在缺乏YDF的MCM存在的情况下，这些暂停的频率要低得多（6.4%），这表明暂停反映了cohesin与YDF区域的分子对接。

总的来说，该研究确定了MCM复合物是环挤压的屏障。MCM是一类新的随机定位和细胞周期特异性屏障的成员，这些屏障阻碍了CTCF-anchored loops和TADs的形成。与那些可渗透的障碍不同，MCM具有两个可以促进屏障功能的显著特征：（1）MCM以拓扑方式结合DNA；（2）YDF无序区域改变了cohesin-MCM碰撞的结果，从阻断到暂停，这表明MCM是具有结合位点的主动化学屏障，而不是被动的物理屏障。

https://doi.org/10.1038/s41586-022-04730-0

制版人：十一

参考文献

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3. Fudenberg, G. et al. Formation of chromosomal domains by loop extrusion.Cell Rep. 15, 2038-2049 (2016)

4. Nora, E. P. et al. Targeted degradation of CTCF decouples local insulation of chromosome domains from genomic compartmentalization.Cell169, 930-944 (2017).

5. Deegan, T. D. & Diffley, J. F. X. MCM: one ring to rule them all.Curr. Opin. Struct. Biol.37, 145-151 (2016).

6. Hyrien, O. How MCM loading and spreading specify eukaryotic DNA replication initiation sites. F1000Res. 5, 2063 (2016).

7. Remus, D. & Diffley, J. F. X. Eukaryotic DNA replication control: lock and load, then fire.Curr. Opin. Cell Biol.21, 771-777 (2009).

8. Das, M., Singh, S., Pradhan, S. & Narayan, G. MCM paradox: abundance of eukaryotic replicative helicases and genomic integrity.Mol. Biol. Int.2014, 574850 (2014).

9. Wohlschlegel, J. A. et al. Inhibition of eukaryotic DNA replication by geminin binding to Cdt1.Science290, 2309-2312 (2000).

10. Wutz, G. et al. Topologically associating domains and chromatin loops depend on cohesin and are regulated by CTCF, WAPL, and PDS5 proteins.EMBO J.36, 3573-3599 (2017).

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