全基因组Perturb-seq揭开基因型-表型景观图谱

撰文 | 十一月

遗传学的核心是对基因型与表型之间的关系进行定义，这对于理解基因和细胞功能至关重要。一般来说，想要揭开基因型与表型关系的方式有两种：正向遗传学方式（Forward genetic）以及反向遗传学方式（Reverse genetic）。正向遗传学方式从表型出发，寻找与表型相关的基因变化；反向遗传学方式以某个感兴趣基因为中心从而进行对不同表型的分析。

CRISPR-Cas9基因编辑技术推动了正向和反向遗传学研究【1】。在正向遗传学筛选方面，CRISPR-Cas9基因编辑通过不同基因扰动对细胞进行分选和测序，为癌症研究、细胞分子生物学机制等方面的研究提供了有力工具。与此同时，单细胞表观遗传学的、转录组学蛋白质组学以及成像信息学方面的发展也逐渐应用于反向遗传学，可以细化对选择性遗传干扰如何影响细胞类型和细胞状态的理解。

为了建立一个全面理解的细胞功能的图谱，2022年6月9日，美国加州大学旧金山分校Jonathan S. Weissman研究组与纪念斯隆·凯特琳癌症中心Thomas M. Norman研究组合作发文题为Mapping information-rich genotype-phenotype landscapes with genome-scale Perturb-seq，利用Perturb-seq【2】、使用紧凑的、多路CRISPRi文库揭开了多种不同细胞类型中数千个功能缺失基因扰动对众多复杂细胞表型以及基因功能的刻画，推进了创建全面的基因型-表型图谱的目标。

Perturb-seq是基于scRNA-seq测序、以汇集的形式同时读出单细胞的CRISPR sgRNA遗传扰动和转录组的方法（图1）。作者们试图通过研究给定细胞类型的一套全面的遗传扰动，对转录组表型进行丰富和理解。Perturb-seq兼容一系列基于CRISPR 干扰。作者们选择使用CRISPRi主要是因为功能缺失型干扰产生表型的比例更高、有助于对蛋白质复合体中不同成员功能进行分析并且不会导致改变转录特征的DNA损伤反应的激活。

图1 Perturb-seq工作流程

作者们首先优化了CRISPRi sgRNA库，其中每个元素包含两个针对同一个基因的不同sgRNAs【3】。随后，作者们设计了包含多个时间点以及不同细胞类型的Perturb-seq筛选方法。表达CRISPRi效应因子dCas9-KRAB【4】的慢性髓系白血病K562细胞作为主要细胞系，在细胞系中作者们进行了两次Perturb-seq筛选，一次是在慢病毒转导后对所有表达基因（N=9866）进行分析，一次是在转导后对所有常见必须基因的分析（N=2057）。另外，作者们也在视网膜上皮细胞系RPE1中进行了类似的实验。与K562细胞相比，RPE1细胞是非癌性的、近整倍体的、贴壁的以及p53阳性的细胞系。

作者们使用基于10x Genomics液滴的3’scRNA-seq以及直接捕获sgRNA的方式进行筛选。通过对细胞中靶基因敲除的效率进行分析，作者们发现K562细胞中靶基因敲除率为85.5%，RPE1细胞中靶基因敲除率为91.6%，证实了该CRISPRi文库的有效性和sgRNA分配的保真度。

随后作者们建立了转录表型景观，并对表型相关的基因功能进行注释。为了验证所建立图谱的有效性，作者们首先对已知的蛋白质复合体成员进行功能分析。Integrator是在小核RNA（snRNA）生物发生和转录终止中发挥作用的蛋白质复合体，共有14个成员。通过Perturb-seq测序的方式，作者们鉴定发现了Integrator复合体中的第15个成员。

另外，通过所建立的图谱，作者们可以对单细胞中非整倍体的遗传驱动因素以及所造成的表型进行分析。最后作者们使用该图谱对线粒体基因组中应激胁迫特异性表达调控网络进行了分析。通过多方面的应用，作者们证实了利用CRISPRi文库进行Perturb-seq测序，进而实现对细胞行为、基因功能以及转录调控网络刻画的有效性。

图 工作模型

总的来说，作者们的工作通过全基因组规模的单细胞CRISPR筛选，丰富了的基因型-表型图谱建立的方式，对于全面推进基因功能的理解提供了新的工作范例。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.05.013

制版人：十一

参考文献

1. Camp, J.G., Platt, R., and Treutlein, B. (2019). Mapping human cell phenotypes to genotypes with single-cell genomics.Science365, 1401–1405.

2. Adamson, B., Norman, T.M., Jost, M., Cho, M.Y., Nun˜ ez, J.K., Chen, Y., Villalta, J.E., Gilbert, L.A., Horlbeck, M.A., Hein, M.Y., et al. (2016). A multiplexed single-cell CRISPR screening platform enables systematic dissection of the unfolded protein response.Cell167, 1867–1882.e21.

3. Replogle, J.M., Norman, T.M., Xu, A., Hussmann, J.A., Chen, J., Cogan, J.Z., Meer, E.J., Terry, J.M., Riordan, D.P., Srinivas, N., et al. (2020). Combinatorial single-cell CRISPR screens by direct guide RNA capture and targeted sequencing.Nat. Biotechnol.38, 954–961

4. Alerasool, N., Segal, D., Lee, H., and Taipale, M. (2020). An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells.Nat. Methods17, 1093-1096.

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