橄榄提取物羟基酪醇的抗氧化作用研究

　　羟基酪醇 (HT) 是从橄榄油中提取的一种天然的多酚类化合物，具有多种生物和药理活性。羟基酪醇的抗氧化性和对自由基的清除能力比其它一些合成的或天然的化合物都要高，能够有效清除内源性和外源性自由基和氧化物[1，2]，是一种有效的抗氧化剂。本研究通过体外培养 HEK-293 细胞，以 H2O2 诱导 HEK-293 细胞损伤模型，研究羟基酪醇 对氧化性损伤的保护作用。
　

1、测试方法

1. 1 细胞内 ROS 测定

　　参考文献 [3] 方法，收集细胞，加入 12. 5、25、50 μM 的羟基酪醇 进行预处理1h，再加入20μM 的 H2O2 作用1h，同时设空白对照组。用荧光比色计测定荧光强度，激发波长 485 nm、发射波长 550 nm、狭缝 4 nm。

　1. 2 细胞内谷光甘肽 ( GSH) 含量的测定

　　参照文献 [4] 方法，收集细胞，加入 12. 5、25、50 μM 的羟基酪醇 进行预处理1h，再加入20μM 的 H2O2 作用1h，同时设空白对照组。用荧光比色计测定荧光强度，激发波长 350 nm、发射波长 420 nm、狭缝 4nm。

　1. 3细胞内 8-羟基脱氧鸟苷 ( 8-OHdG) 免疫组化分析

参照 Yarborough 等的方法[5]略加改进。培养细胞，将细胞接种于底部放有盖玻片的 24 孔板上，37℃ 培养24 h。加入 12. 5、25、50 μM 的羟基酪醇，再加入 20μM 的H2O2，设立空白对照组。取出盖玻片干燥后用冷丙酮固定。加入 Triton X-100、封闭、一抗、二抗、染色、显微镜下阅片。应用 Image-pro plus 4. 5. 1 图象分析系统进行定量图象分析，随机选择 50 个细胞，用测得的光密度值 ( 数值放大 1 000 倍) 表示 8-OHdG 阳性表达的相对强弱。

1. 4 统计分析

　　采用 SPSS 11. 5 对结果进行分析，数据以均数 ± 标准差表示，各组间均数比较采用单因素方差分析，两组均数比较采用 t 检验，显著性水准为 0. 05 和 0. 01。3 结果与分析

2、结果与分析

2. 1HT 对 H2O2所致 ROS 生成增多的影响

与空白对照组比较，H2O2 损伤模型组细胞内 ROS水平明显升高 ( P < 0. 05) 。在羟基酪醇1 ( 12. 5μM) 、HT2( 25μM) 、HT3 ( 50μM) 各预处理组细胞内，与 H2O2损伤模型组比较，预处理组羟基酪醇3 ( 50μM) 细胞内的 ROS水平明显降低，并呈剂量依赖关系 ( P < 0. 05) ，表明抗氧化剂羟基酪醇 能抑制细胞内 ROS 的生成 ( 图 1) 。

　2. 2羟基酪醇对 H2O2所致 HEK-293 细胞 GSH 下降的影响

　　与空白对照组比较，H2O2 损伤模型组细胞内 GSH水平明显下降 ( P < 0. 01) 。与 H2O2 损伤模型组比较，HT 预 处 理 组羟基酪醇1 ( 12. 5μM) 、HT2 ( 25μM) 、HT3( 50μM) 细胞内的 GSH 水平升高，并呈剂量依赖关系( P < 0. 05) ( 图 2) 。

　　2. 3羟基酪醇对 H2O2所致 HEK-293 细胞内 8-OHdG 表达水平的影响

　　在显微镜下观察，细胞内 8-OHdG 阳性物质呈棕黄色，主要集中在细胞核中。与空白对照组比较，H2O2损伤模型组细胞内细胞核的着色明显增加。在预处理组HT1 ( 12. 5μM) 、HT2 ( 25μM) 、HT3 ( 50μM) 细胞内，随着羟基酪醇剂量的增加细胞核的着色减轻。经定量分析，预处理组随着羟基酪醇 浓度的增加，HEK-293 细胞核的平均光密度值降低，与损伤模型组比较，差别具有显著性差异 ( P < 0. 05) ( 图 3) 。

3、讨论

　　抗氧化作用是指抗氧化活性物质通过抑制自由基的产生、清除自由基来抑制自由基参与的过氧化反应[6]。一些外源性化合物进入体内后，活化机体细胞中的氧而产生 ROS，其对大多数细胞都具有毒性作用。GSH 为细胞内分布最广的非蛋白巯基化合物，是非酶性抗氧化剂，能够清除氧自由基。GSH 最重要的功能基团巯基( -SH) 与 ROS 直接结合，缓冲 ROS 对生物膜、酶受体等的损伤[7]，对 DNA、蛋白质、脂类等生物分子的氧化损伤具有重要的保护作用。

　　抗氧化物质主要通过抑制 ROS 和过氧化氢的产生，减少DNA的氧化损伤。以往的研究表明，羟基酪醇对 DNA氧化性损伤具有很强的保护作用[8，9]。在本研究中，提前加入不同剂量 ( 12. 5—50μM) 的抗氧化剂羟基酪醇，能够降低 ROS 的升高，并恢复 GSH 水平的降低。引起 DNA 损伤的机制有很多，其中最重要的是氧化性损伤。在众多 DNA 氧化损伤产物中，以 8-OHdG 最为常见，它是 ROS 破坏 DNA，引起 G: C 到 T: A 突变的产物[10]，是评价 DNA 氧化损伤的敏感指标和生物标志物[11，12]。本研究结果表明，抗氧化剂羟基酪醇可降低HEK-293细胞内8-OHdG 表达水平。

综上所述，羟基酪醇具有抗氧化作用和抑制自由基的功能，在 H2O2 诱发的细胞损伤中，能够有效阻止 HEK-293 细胞 DNA 的氧化性损伤，起到重要的保护作用。

　　参考文献

　　[1] Visioli F，Bellomo G，Galli C. Free radical-scavenging prop-erties of olive oil polyphenols [J] . Biochem Biophys ResCommun，1998，247: 60 – 64.

　　[2]Auroma OI，Delane M，Jenner A，et al. Effects of hydroxyty-rosol found in extra virgin olive oil on oxidative DNA damageand on low-density lipoprotein oxidation [J] . Agric. FoodChem，1998，46: 5158-5187.

　　[3]Sohn JH，Han KL，Lee SH，et al. Protective effects of pandu-ratin A against oxidative damage of tert-butylhydroperoxide inhuman HepG2 cells [J] . Biol. Pharm. Bull，2005，28:1083-1086.

　　[4] LeBel CP，Ischiropoulos H，Bondy SC. Evaluation of theprobe 2'，7'-dichlorofluorescin as an indicator of reactive ox-ygen species formation and oxidative stress [J] . Chem.Res. Toxicol，1992，5: 227-231.

　　[5]Yarborough A，Zhang YJ，Hsu TM，et al. Immunoperoxidase detection of 8-hydroxydeoxyguanosine in aflatoxin B1-treatedrat liver and human oral mucosal cells [J] . Cancer Res，1996，56: 683-688.

　　[6]乔凤云，陈欣，余柳青 . 抗氧化因子与天然抗氧化剂的研究综述 [J] . 科技通报，2006，22 ( 3) : 332-336.

　　[7]Sen CK. Redox signaling and the emerging therapeutic poten-tial of thiol antioxidants [J] . Biochem. Pharmacol，1998，55 ( 11) : 1747-1758.

　　[8]Zhang XM，Jiang LP，Geng CY，et al. Inhibition of Sudan I genotoxicity in human liver-derived HepG2 cells by the an-tioxidant hydroxytyrosol [J] . Free Radic Res，2008a，42:189-195.

　　[9]Zhang XM，Jiang LP，Geng CY，et al. Inhibition of acrylam-ide genotoxicity in human liver-derived HepG2 cells by theantioxidant hydroxytyrosol [J] . Chem Biol Interact，2008b，176: 173-178.

　　[10]Breton CV，Kile ML，Catalano PJ，et al. GSTM1 and APE1genotypes affect arsenic-induced oxidative stress: a repeated measures study [J] . Environ Health，2007，69 ( 1) : 39.

　　[11]Kasai H. Analysis of a form of oxidative DNA damage，8-hy-droxy-2'-deoxyguanosine，as a marker of cellular oxidativestress during carcinogenesis [J] . Mutat Res，1997，387( 3) : 147-163.

　　[12]Henle ES，Linn S. Formation，prevention and repair of DNA damage by iron /hydrogen peroxide [J] . Biol. Chem，1997，272 ( 31) : 19095-19098.

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