Biomaterials | 靶向线粒体的磁致热纳米酶用于磁诱导协同癌症治疗

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*本文首发于“纳米酶Nanozymes”公众号，2021年4月24日

*编辑：俞纪元

背景介绍

磁热疗法（magnetic hyperthermia therapy，MHT）是依靠磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）在交变磁场（alternating magnetic field，AMF）中的热量来加热患病组织和损伤细胞的一种治疗手段。由于磁场不受深度的限制，且这种局部发热对健康组织的副作用也很小，许多具有优良磁热性能的纳米材料被用于磁热疗法。

芬顿反应（Fenton reaction）是Fe2+催化H2O2产生具有强氧化性的·OH的反应，许多针对肿瘤的治疗手段都利用了芬顿反应在肿瘤部位产生的具有毒性的·OH，达到杀伤肿瘤细胞的目的。2007年阎锡蕴团队发现Fe3O4纳米颗粒具有类过氧化物酶活性，能够催化H2O2产生·OH，随后将其定义为纳米酶。许多工作都报道了这些能够分解产生Fe2+的铁基纳米材料可在呈微酸性的肿瘤微环境中将过多的H2O2转化为·OH，从而造成细胞死亡，抑制肿瘤生长。

线粒体是细胞内的重要细胞器，参与许多重要的生理过程。相较于常规化疗药物，线粒体具有克服耐药机制的潜力，是优良的抗癌药靶标。例如三苯基膦和线粒体穿透肽均被报道作为线粒体靶向物在单分子和纳米药物中得到应用，并取得了良好的抗癌效果。具有多种优良特性的亲脂性铱（III）阳离子配合物也被报道可作为线粒体靶向药物。

基于此，中山大学化学学院生物无机与合成化学重点实验室的巢晖团队、上海师范大学资源化学重点实验室和上海市稀土功能材料重点实验室的杨仕平和周治国团队共同开发了一种由具有线粒体靶向性的铱配合物修饰的铁锰氧化物纳米颗粒（Ir@MnFe2O4 NPs），这种纳米颗粒在AMF下会引起局部温度升高，导致线粒体损伤和细胞死亡。同时，纳米颗粒还具有谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭作用，反应过程中产生的H2O2又通过芬顿反应被分解为具有氧化毒性的·OH，从而进一步加剧肿瘤细胞的损伤、抑制肿瘤的生长。

Ir@MnFe2O4 NPs的合成及其作为线粒体靶向磁致热纳米酶用于磁诱导治疗示意图

图文导读

图 1 制备与表征

A. MnFe2O4 NPs的TEM图像；B. Ir@MnFe2O4 NPs的TEM图像；C. 三种样品的傅里叶变换红外光谱；D. Ir@MnFe2O4 NPs的XPS光谱；E. 三种样品的UV-Vis吸收光谱；F. Ir与Ir@MnFe2O4 NPs的发射光谱。

根据图1A和B的TEM图像可以看到，合成的颗粒粒径大小均一，分散性良好。图1C显示Ir@MnFe2O4 NPs的傅里叶变换红外光谱中检测到了Fe-O、C=O和N-O的特征吸收，表明有MnFe2O4 NPs被合成，并且铱复合物也被成功修饰到了颗粒表面。XPS谱图结果显示了Mn、Fe、O、Ir等元素的存在（图1D）。图1E和F进一步证明铱复合物成功修饰至MnFe2O4 NPs的表面。

图 2 Ir@MnFe2O4 NPs在水溶液中的磁热性质

A. 不同的温度和磁场条件下Ir@MnFe2O4 NPs与MnFe2O4 NPs的磁滞回线；B. 在不同频率的AMF下Ir@MnFe2O4 NPs的温度随时间变化曲线；C. 在598kHz AMF下不同浓度Ir@MnFe2O4 NPs的温度随时间变化曲线；D. Ir@MnFe2O4 NPs溶液在磁场交替开、关下的温度变化情况。

研究人员在不同的温度和磁场条件下研究了这些NPs的磁滞现象，在室温条件下没有磁滞现象，这表明NPs是超顺磁性的（图2A）。不同频率的AMF下温度均随时间升高（图2B），并且随着材料浓度的升高，温度上升的速度也愈快（图2C），这表明NPs在AMF下能够产生热量，具有良好的磁致热性能。并且，在磁场交替开、关循环几次后温度依然能够上升，说明材料具有很好的磁热稳定性（图2D）。

图 3 Ir@MnFe2O4 NPs在水溶液中的磁致热纳米酶催化活性

A. 有/无GSH时不同浓度Ir@MnFe2O4 NPs溶液的紫外-可见光吸收光谱; B. GSH存在时Ir@MnFe2O4 NP溶液在不同温度下的紫外-可见光吸收光谱；C. DMPO、H2O2、GSH和Ir@MnFe2O4 NPs水溶液在不同温度下的ESR谱；D. 不同温度条件下Ir@MnFe2O4 NPs生成·OH的脱色比色分析（1. MB + Ir@MnFe2O4 NPs；2. MB + Ir@MnFe2O4 NPs + H2O2；3.MB + Ir@MnFe2O4 NPs + H2O2+GSH+25℃；4. MB + Ir@MnFe2O4 NPs + H2O2+GSH+37℃；5. MB + Ir@MnFe2O4 NPs + H2O2+GSH+42℃）。

二硫代硝基苯甲酸（DTNB）与Fe（II）反应会生成在512 nm处具有特征吸收的配合物，图3A显示Fe + GSH组在512 nm处的吸收强度增强，且溶液颜色有所加深，表明NPs与GSH反应产生了Fe（II）。随着温度的升高溶液颜色加深，表明NPs的磁热性质加快了Fe（II）的产生和GSH的消耗（图3B）。在ESR分析·OH产生情况的结果中，在GSH和H2O2存在时可看到明显的·OH信号，并且信号强度随温度升高而增强。而没有GSH的条件下则没有明显的信号（图3C）。这些结果表明GSH的加入催化芬顿反应生成Fe（II），而温度的升高促进了·OH的生成。对亚甲基蓝（methylene blue，MB）催化脱色作用的比色分析（A/A0），进一步显示了Ir@MnFe2O4 NPs作为磁致热纳米酶具有用于磁诱导协同治疗癌症的潜力（图3D）。

图 4 Ir@MnFe2O4 NPs的线粒体靶向性

A. 不同浓度Ir@MnFe2O4 NPs与HeLa细胞共孵育24h后的细胞活性；B. Ir@MnFe2O4 NPs与Mito Tracker Deep Red（MTDR，可染活细胞中线粒体的红色荧光染料）在HeLa细胞中的共定位情况；C. ICP-MS分析HeLa细胞内铱元素的分布情况；D, E. Ir@MnFe2O4 NPs处理3h和6h后HeLa细胞的TEM图像。

Ir@MnFe2O4 NPs与HeLa细胞共孵育24h后，浓度为0.4 mg/mL时，有超过85%的细胞存活，表明Ir@MnFe2O4 NPs毒性较低（图4A）。图4B显示Ir的黄色荧光与MTDR的红色荧光表现出良好的重叠，证明了Ir@MnFe2O4 NPs的线粒体靶向性。定量分析Ir在HeLa细胞中分布的结果进一步验证了Ir@MnFe2O4 NPs的线粒体靶向性（图4C）。通过TEM图像也可以看到，Ir@MnFe2O4 NPs处理细胞3h后NPs主要位于细胞溶酶体中，而6h后则定位在线粒体中，这表明在NPs在进入细胞后首先进入溶酶体，随后才在线粒体中积聚（图4D、E）。

图 5 Ir@MnFe2O4 NPs体外抗肿瘤细胞实验

A. ROS探针检测细胞内·OH的产生情况；B. 活死细胞荧光染色图像。

用DCFH-DA探针检测了HeLa细胞中ROS的产生情况，观察到了明显的绿色荧光，表明在AMF下NPs处理会使细胞中产生大量的ROS。图B的结果显示，在AMF下Ir@MnFe2O4 NPs处理后，许多细胞都发生了死亡。

图 6 Ir@MnFe2O4 NPs体内T2加权磁共振成像、双光子成像能力与肿瘤治疗情况

A. 荷瘤小鼠注射Ir@MnFe2O4 NPs前后的T2加权MRI成像情况；B. Ir@MnFe2O4 NPs在活细胞中的单光子和双光子显微成像情况；C. 小鼠肿瘤体积随时间变化图；D. 小鼠体重随时间变化图；F. 不同治疗后热休克蛋白HSP70免疫反应性的变化；G. 不同治疗后0 d和14 d的裸鼠照片。

对荷瘤小鼠进行T2加权核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI），在瘤内注射前后拍摄的图像显示，Ir@MnFe2O4 NPs具有良好的负性造影信号，说明NPs是一种有效的MRI造影剂（图6A）。并且NPs具有双光子活性，可进行双光子成像（two-photon imaging，TPM）（图6B），这些特性都使NPs能够指导磁诱导的协同治疗。瘤内注射15天后AMF下的治疗组小鼠肿瘤的生长得到了明显的抑制（图6C），且小鼠的体重未受影响（图6D）。同时，治疗组小鼠热休克蛋白水平明显升高，表明在AMF条件下NPs能够放热并有效抑制肿瘤的生长（图6E、F）。

总结与展望

本文所提出了一种具有线粒体靶向性的磁致热纳米酶Ir@MnFe2O4 NPs可用于磁诱导协同治疗肿瘤，并且能够作为成像的造影剂指导治疗。进入肿瘤细胞的Ir@MnFe2O4 NPs可产生细胞毒性·OH并导致GSH的耗竭。在AMF下，具有磁性的Ir@MnFe2O4 NPs可诱导局部磁热疗，不仅会对肿瘤细胞造成损伤，还会加速·OH的生成和GSH的损耗，进一步增强治疗效果。此外，由于其优异的磁性和光学特性，该纳米平台还可用于TPM体外成像和MRI体内成像。

原文：Shen J, Rees TW, Zhou Z, Yang S, Ji L, Chao H: A mitochondria-targeting magnetothermogenic nanozyme for magnet-induced synergistic cancer therapy. Biomaterials 2020;251:120079. 10.1016/j.biomaterials.2020.120079

撰稿：王前

校审：朱晨欣

编辑：周逸夫