全面助力新药研发，挑战DDR靶点之PRMT5|酶学检测|爱思益普

1992年，科学家在研究果蝇杂交时，发现同时突变两个特定基因时，果蝇死亡；而突变其中任何一个都不会给果蝇带来致命突变的现象。随后1946年，将这种“同时具有两种特定基因突变时细胞死亡，而其中任何一个突变或不发挥作用时，都不会导致细胞死亡”的现象命名为“合成致死。”一直到1997年，“合成致死”都只是一个概念。直到Stephen Friend在《Science》上首次提出“合成致死理念可以用来研发抗癌药物”，将“合成致死”和癌症联系在一起。

合成致死示意图

2014年，全球第一个“合成致死”的抗癌药物PARP（多聚ADP核糖聚合酶）抑制剂奥拉帕利被批准用于治疗卵巢癌。随后2016年上市的卢卡帕利、2017年上市的尼拉帕利、2018年的他拉唑帕利也迅速获批，PARP的研究成为了热潮。而“合成致死”靶点也成为了研究者最为关注的一个方向，谁会成为下一个“PARP”也令人期待。在2016年《Science》上报道了新“合成致死”组合——PRMT5/MTAP，也迅速成为各大药企重点关注对象。

机理研究

PRMT5（蛋白质精氨酸甲基转移酶），是一种II型精氨酸甲基转移酶，属于PRMT家族，是S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）依赖性甲基转移酶的最大类别（I类），负责将甲基从AdoMet转移到组蛋白和其他蛋白质的精氨酸侧链，可催化ω-NG-单甲基和ω-NG，N′G对称二甲基精氨酸残基的形成。PRMT5可以甲基化多种底物，包括p53、组蛋白H2A、H3、H4，不同底物的甲基化带来不同的功能，如PRMT5高甲基化启动子组蛋白H3R8和H4R3，会触发细胞周期调节和肿瘤抑制基因的转录沉默等。PRMT5通过对底物精氨酸的甲基化修饰参与DNA修复、细胞周期、转录调控，对各种细胞功能具有至关重要的影响。

PRMT家族功能（来源：圣和官网）

PRMT5除了以上功能，还与MTAP构成“合成致死”，更准确来说应该是“旁系致死”。有报道显示，甲基硫代腺苷磷酸化酶（MTAP）基因缺失导致MTAP缺失的癌症对PRMT5的依赖性增加。进一步研究发现，MTAP基因与肿瘤抑制基因CDKN2A相邻，并且有15%的人类癌症这两个基于共同丢失。MTAP是正常细胞的一个管家基因，是甲硫氨酸和嘌呤合成补救途径中的一个关键基因，催化MTA（甲硫腺苷）生成甲硫氨酸，对维持正常细胞功能至关重要。MTAP基因的缺失造成细胞内积累MTA,而MTA会和PRMT5的底物S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）竞争，导致PRMT5活性下降。

PRMT5/MTAP合成致死机制

研究进展

目前PRMT5抑制剂还无上市药物，有7个处于临床阶段。其中进展最快的是葛兰素史克的GSK3326595，目前处于II期临床研究阶段，适应症是乳腺癌、急性髓系白血病、非霍金淋巴癌等，另外该公司还有2款目前处于临床前阶段；此外，安进的公司开发的AMG-193也处于临床I/II期阶段，用于非小细胞肺癌的治疗；辉瑞的PF-06939999用于实体瘤和食道管癌。值得一提的是，南京圣和药业的PRMT5小分子抑制剂SH3765也处于临床I期，是国内首个获批的PRMT5抑制剂。而今年4月份AACR上，先声药业也公布PRMT5抑制剂SCR-6277,并提交临床I期测试申请。

前处于临床阶段的PRMT5抑制剂

这些临床PRMT5抑制剂队列的作用机制主要是SAM竞争/非竞争性抑制剂。其中GSK3326595属于非竞争性抑制剂，带有的四氢异喹啉可以和SAM之间的阳离子-π相互作用，与PRMT5特有的残基Phe327形成潜在的π-π堆积作用，并与Leu319、Tyr324、Phe327和Trp579形成的疏水小口袋影响PRMT5的催化过程。圣和开发的SH3765是由GSK-3326595改构而来，主要在GSK-3326595的嘧啶酰胺部分进行了改造。

SAM竞争性抑制剂，如强生的JNJ64619178是一个进入临床试验的SAM结构类似物，对SAM中的四氢呋喃环以及嘌啉上的氨基进行改变；辉瑞的PF-06939999、PreludeTherapeutics的PRT543、PRT811也是核苷类似物。

PRMT5抑制剂类型

在安全性方面，这些化合物对PRMT5的阻断出现了剂量限制性毒性，如血小板减少，贫血，中性粒细胞减少等。这可能与这些抑制剂无选择性的抑制PRMT5，而PRMT5对造血基因的调节至关重要。

随着Mirati在2021年AACR会议上公布的另一款PRMT5抑制剂——MRTX1719，将PRMT5与“合成致死”再次联系起来。利用缺失MTAP细胞中，MTA积累会与PRMT5优先结合的机制，选择性的抑制肿瘤细胞中的PRMT5功能，而正常细胞PRMT5功能相对保留。

MTA对PRMT5 SAM口袋结合的优先级是其他PRMTs结合口袋的100倍，这就减少了SAM与PRMT5的结合，进而限制PRMT5的甲基转移酶活性，同时也会减弱类似于GSK3326595这种类型化合物与底物口袋的结合。低浓度的MTA与PRMT5抑制剂可能协同抑制PRMT5，但是在高浓度的MTA时，协同作用减弱。因此，找到抑制PRMT5/MTA复合物的抑制剂，才能更精准的靶向MTAP基因丢失的癌细胞。

MRTX1719作用机制（来源：Mirati官网）

AACR会议上公布的MRTX1719正是基于这种机制，可以有效的抑制PRMT5/MTA复合物，根据会议公布的结果可以看到MRTX1719在PRMT5/MTA上具有更加potency的抑制效果，在MTAP缺失细胞中和MATP野生型细胞中具有明显的选择性，这说明MRTX1719可以选择性的靶向MTAP缺失的癌细胞，对正常细胞影响会小。

MRTX1719选择性抑制PRMT5•MTA复合物（来源：Mirati官网）

基于MTase-Glo的方法，利用甲基转移酶将SAM(S-腺苷甲硫氨酸)提供甲基给底物，生成SAH的特性，爱思益普开发了PRMT5 甲基转移酶活性测试实验。为了更好的筛选出PRMT5/MTA复合物，我们也开发出了PRMT5/MTA甲基转移酶活性测试。除了以上的几种研究方向，也有药企将方向放在了PRMT5不同底物结合位点上，开发出在不同底物上具有选择性的药物。因此，我们也开发出了针对不同底物，在不同底物下有无MTA状态下的PRMT5体外酶活抑制实验。

数据来源于ICE

爱思益普目前拥有强大的Drug Discovery Bioscience技术团队支持药物活性评价的一体化研究，在DNA损伤和修复、合成致死领域积极布局，如针对PRMT5，目前也在构建HCT116-MTAP KO细胞系，如细胞学层次上评价Wee1抑制引起的细胞周期变化、DNA损伤、CDK1、CDK2活化水平、细胞凋亡、cell panel筛选药物敏感细胞系等等维度的评价；结合PK-ADME的平台，可以评价药物对CYP3A4抑制，及成药性方面的优化；ICE的hERG筛选、KinomeOneTM310 –kinase panel、SafetyOneTM 47/90 - Safety panel以及CardiacOneTM - Cardiac safety panel更能在选择性上和安全性上给予更多数据支持和研究。爱思益普专注创新领域，愿意与合作伙伴一同加速中国创新药物研发进程。

参考文献

1.J. Med. Chem. 2022, 65, 3, 1749–1766 Publication Date:January 18, 2022

2. Bing xiong; Allosteric Modulation: Dynamics is Double-“E”dged; J. Med. Chem. 2021, 64, 3694−3696.

3. Yuanxiang Wang et al; Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) as an Anticancer Target and ItsInhibitor Discovery; J. Med. Chem. 2018, 61, 9429−9441

4. Yudao shen et al; Discovery of First-in-Class Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) Degraders; J. Med. Chem. 2020, 63, 9977−9989.

5. AACR-NCI-EORTC 2021:MRTX1719: A First-in-class MTA-cooperative PRMT5 Inhibitor that Selectively Elicits Antitumor Activity in MTAP/CDKN2A Deleted Cancer Models.

6.Bedford, M. T.; Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol. Cell 2009, 33 (1), 1– 13.

7.Antonysamy,S.Proc.Natl.Acad SciUSA.2012,109(44),17960–17965.

8. Michael K. C. Lee et al; PRMT5: An Emerging Target for Pancreatic Adenocarcinoma; Cancers 2021,13, 5136.