未来国自然热点：线粒体质量控制新机制—线粒体胞吐Mitocytosis

今天推荐的文献解读是来自清华大学生命科学联合中心膜生物学国家重点实验室、生命科学学院生物结构研究中心、医学院免疫研究所及台湾彰化基督教医院线粒体医学与自由基研究中心多个课题组于2021年4月27日发表在Cell的题为“Mitocytosis, a migrasome-mediated mitochondrial

quality-control process”，即线粒体胞吐是迁移体介导的线粒体质量控制过程。

作为真核细胞的重要细胞器之一，线粒体通过多种质控机制清理受损线粒体，维持细胞内线粒体稳态(Youle, 2019)。线粒体质控机制包括线粒体蛋白酶和蛋白酶体介导的线粒体外膜（outer mitochondrial membrane, OMM）蛋白降解、线粒体衍生囊泡（mitochondrial-derived vesicles, MDVs）降解以及线粒体自噬（mitophagy）等 (Pickles et al. 2018)。线粒体脱落是介导线粒体细胞间水平转移的一种机制(Hayakawa et al., 2016; Torralba et al ., 2016)，在线粒体质控中也有一定作用(Melentijevic et al., 2017)。若不及时处理受损线粒体，将导致大量死亡因子的释放，造成健康线粒体稳态失衡，甚至诱导细胞凋亡。这篇文章是通过研究迁移体（Migrasome）介导的线粒体质量控制过程，揭示一种新的线粒体质量控制机制，被命名为线粒体胞吐（Mitocytosis）。

2015年，清华大学俞立团队发现一种新型细胞器——迁移体(Ma et al., 2015)。在细胞迁移中，细胞后缘拉出收缩丝，上有囊泡结构的迁移体。随着细胞迁移收缩丝断裂，细胞内容物通过迁移体被释放。迁移体的形成依赖迁移。使用肌球蛋白II抑制剂blebbistatin 可阻断迁移，通过调节细胞粘附亦可抑制迁移体形成 (Wu et al., 2017)。四次跨膜蛋白成员是迁移体形成的关键调节因子(如：TSPAN4和TSPAN9)。迁移体的形成是富含四次跨膜蛋白的宏结构域的组装过程，该过程增强了迁移体膜的刚性和弯曲度，介导了迁移体的形成，被称之为膜增强模型（membrane stiffening model）(Huang等人, 2019)。近来，迁移体被报道在斑马鱼器官发生中发挥重要作用(Jiang et al., 2019)，在斑马鱼原肠胚发育中，迁移体以非自主性方式整合空间和化学信号调节器官形态发生。

1.外界压力因素诱发线粒体胞吐

作者首先用CCCP（一种强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂）处理已做迁移体标记（表达TSPAN4-GFP）和线粒体标记（MitoDsRed）的L929细胞，观察到迁移体内部的MitoDsRed信号。进一步分离并TEM观察CCCP处理前后的迁移体，发现受损的线粒体在迁移体内富集，作者把这些含线粒体的迁移体称为线粒体残迹（Mitosomes）。单个线粒体残迹可以包含多个较小的（平均尺寸240nm）受损线粒体。研究人员把细胞经迁移体将受损线粒体释放出去这一现象命名为线粒体胞吐（Mitocytosis）。进一步研究表明，不同的外界压力因素均会引起线粒体胞吐，可发生在不同细胞中，因此，线粒体胞吐是大多数细胞线粒体质控的一种通用机制。

2.线粒体胞吐中的线粒体定位与动力学

作者接着通过延时成像发现大量高度动态的管状线粒体向外延伸，当其顶端接近质膜时，发生裂变产生碎片粘附在近质膜区域。最终，当细胞迁移时,“捕获”的线粒体碎片随收缩丝进入迁移体。相反，对照组细胞线粒体延伸到质膜，仅从质膜缩回。TEM分析表明，线粒体网络分两个区域，细胞底部的受损线粒体和细胞中部正常的线粒体。这表明受损线粒体被运输到细胞的底部,并最终通过线粒体胞吐被细胞排出。

3.KIF5B, Drp1和Myosin19是线粒体胞吐的必需基因

作者接着研究了各种因素对线粒体动力学的作用。通过基因敲除、基因过表达、延时显微镜摄影等实验手段研究了KIF5B、Drp1和Myosin19对线粒体动力学的作用。这些数据表明KIF5B将线粒体拉到质膜介导线粒体胞吐；Myo19连接线粒体与肌动蛋白；最后，与肌动蛋白结合的管状线粒体在Drp1介导下发生裂变，然后进入迁移体，即KIF5B、Myosin19、Drp1分别通过调控线粒体的运输、定位和分裂，介导线粒体胞吐。

4.敲除动力蛋白促进正常状态细胞的线粒体胞吐

作者进一步发现敲除微管动力蛋白dynein足以让未受外界压力因素作用的细胞发生线粒体胞吐，但这一过程可被敲除KIF5B、Myosin19、Drp1阻断。这说明动力蛋白敲除和线粒体应激源诱导的线粒体胞吐受相同通路调控。

5.线粒体胞吐中的线粒体具有低线粒体膜电位（MMP）和高ROS的特点

为了进一步验证迁移体中的线粒体是受损线粒体。（1）作者检测了受损线粒体的ROS指标，用MitoSOX（标记高ROS线粒体）染色细胞，发现迁移体中的线粒体大多为MitoSOX阳性和TMRM（活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光）阴性，提示迁移体中线粒体MMP降低。（2）接着作者研究了线粒体MMP降低发生在线粒体胞吐前还是之后。CCCP处理细胞和TMRM染色，数据初步表明线粒体损伤发生在线粒体胞吐之前。（3）作者进一步利用3D活细胞激光共聚焦成像分析，研究了细胞底部、中间、上面不同区域的线粒体特征，发现细胞底部大多数线粒体MMP降低，而细胞中部大多线粒体MMP正常；此外，细胞底部线粒体ROS高于细胞中部。这些数据表明，线粒体失去MMP和产生ROS发生在线粒体胞吐之前。

6.线粒体胞吐选择性地清理含mtDNA有害突变的线粒体

作者推测，如果线粒体胞吐可排出受损线粒体，那么含mtDNA有害突变的线粒体也应被线粒体胞吐选择性清理。作者利用线粒体异质性细胞模型验证了该假设。结果表明，含mtDNA有害突变的线粒体被线粒体胞吐选择性的清除。

7.受损线粒体募集的动力蛋白减少

作者根据TME分析，推测受损线粒体可能被选择性的运输至细胞外周。为验证该假设，（1）作者首先分析了单个线粒体的KIF5B和动力蛋白， 10μM CCCP处理细胞时，动力蛋白募集显著降低， KIF5B募集增加；2μM CCCP处理细胞，动力蛋白募集稍微减少，对KIF5B募集无影响，这并不意外，因为该处理剂量只有少量的受损线粒体。（2）作者进一步开展体外实验加以验证。从对照组或10μM CCCP处理组分离线粒体，与从稳定表达GFP-tagged KIF5B和mCherry-tagged DYNLL1的细胞系中分离的S-100 胞液片段共孵育，洗脱和分析线粒体募集的外源标记蛋白。结果表明，CCCP处理组线粒体动力蛋白募集能力显著降低，KIF5B募集能力显著增强。（3）为了直接验证是否受损线粒体与动力蛋白无关，而选择性的募集KIF5B，作者做了改良的体外结合实验，以判断正常的和受损的线粒体。2μM CCCP处理细胞使线粒体受损，分离线粒体进行基于低或高MMP的荧光激活细胞分选（FACS），应用于结合实验中。结果表明，高或低TMRM的线粒体群体能募集相似水平的KIF5B；动力蛋白的募集在低TMRM线粒体群中显著减少，提示受损线粒体的确倾向于避免结合动力蛋白。这些数据表明，在CCCP处理细胞中，受损线粒体的状态信号到达细胞外周通过两个途径，一是通过其自身避免与动力蛋白结合，二是通过整体上增强线粒体中KIF5B的募集。

8.线粒体胞吐保护细胞免受线粒体压力

为验证线粒体胞吐是否是保护线粒体的一种质控机制，（1）作者首先过表达TSPAN4或TSPAN9构建增强迁移体形成的细胞系，敲除动力蛋白构建了增强线粒体向迁移体易位的细胞系。发现两种处理均可以显著保护细胞免受CCCP诱导的MMP丧失。（2）为进一步验证这种保护效应是否由线粒体胞吐引起，作者在过表达TSPAN4或TSPAN9的细胞及敲除动力蛋白的细胞中敲除KIF5B，发现可逆转四跨膜蛋白过表达和动力蛋白敲除的保护效应。说明这种保护效应是由线粒体胞吐引起的。（3）作者推断，过表达四跨膜蛋白或敲除动力蛋白，通过逐渐增强线粒体胞吐保护细胞在CCCP作用下不丧失MMP，因此，当受到严重的CCCP处理时，也应该看到MMP恢复在增强。为验证该假说，作者将对照组、TSPAN4表达组和动力蛋白敲除组细胞用CCCP处理1h，普通培养基培养9h。当CCCP处理1h后，所有细胞MMP相似。然而，9h后，TSPAN4表达组和动力蛋白敲除组细胞比1h处理细胞具有更高的MMP，对照组细胞MMP仅有微弱恢复。这些结果说明线粒体胞吐逐渐促进MMP恢复。（4）作者还应用海马分析验证了线粒体的呼吸潜力。发现过表达TSPAN4或TSPAN9的细胞、或动力蛋白敲除细胞，保护了CCCP处理后的呼吸潜力。最后，作者应用MtKeima分析检测了线粒体自噬水平。发现2μMCCCP处理可诱导微弱的自噬信号，且可被增强的线粒体胞吐减弱。相反，10μM CCCP诱导较强的自噬信号，但不能被增强的线粒体胞吐减弱。这些数据说明线粒体胞吐可减轻中度线粒体损伤。

9. 线粒体胞吐维持分化巨噬细胞的线粒体稳态

巨噬细胞可形成迁移体且CCCP可引起巨噬细胞线粒体胞吐。（1）作者发现骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）可在无涂层处理的玻璃表面形成迁移体，但在亲水处理的表面无法形成，且可引起显著的MMP丧失，这意味着维持BMDMs的MMP必需依赖于迁移体的形成。（2）为研究线粒体胞吐在BMDMs中的作用，作者构建了TSPAN9敲除小鼠，从WT和TSPAN9-/-小鼠中分离单核细胞，体外培养分化为BMDMs。发现TSPAN9-/-小鼠的BMDMs中，迁移体形成显著减少， MMP显著降低。（3）为研究MMP降低是由线粒体胞吐引起，还是不依赖线粒体胞吐由TSPAN9的功能所造成，作者将TSPAN9转染至TSPAN9-/-巨噬细胞，在未处理或亲水处理的培养皿表面培养。在未处理培养组，表达TSPAN9部分逆转了迁移体和MMP的形成，反之，亲水处理组不支持迁移体的形成。因此，TSPAN9可能通过线粒体胞吐调控MMP。（4）为研究线粒体胞吐在更加接近生理条件下的作用，作者从WT和TSPAN9-/-小鼠中分离腹膜巨噬细胞。发现TSPAN9-/-小鼠腹膜巨噬细胞的MMP减少。有趣的是，WT和TSPAN9-/-小鼠分离的非迁移肝脏细胞MMP没有差异，说明敲除TSPAN9不影响非迁移细胞的MMP。这些数据说明线粒体胞吐维持分化巨噬细胞的线粒体稳态。

10. 线粒体胞吐维持体内中性粒细胞的线粒体质量

为研究线粒体胞吐的体内生理作用，（1）作者以中性粒细胞为研究对象，一是其高迁移性，二是体循环中非常丰富。首先尾静脉注射PE-labeled anti-Ly-6G标记小鼠中性粒细胞，应用单光子转盘式共聚焦显微镜观察肝脏和脾脏。结果表明，体内染色标记细胞方法有效，中性粒细胞产生了大量迁移体。（2）接着，作者研究了中性粒细胞的迁移体中是否含有线粒体。作者分离了中性粒细胞，用Mito-SOX染色标记受损的线粒体，然后将其注射到小鼠体内。结果表明，许多中性粒细胞产生的迁移体具有Mito-SOX信号；从血液中分离的迁移体，87%产生于中性粒细胞。作者制作迁移体超薄切片，TEM观察发现，分离的迁移体高度同质，具有迁移体的形态学特征。相应地，分离的迁移体也含有各种迁移体和线粒体的标记物。因此，体内的确存在线粒体胞吐现象。（3）接下来，作者研究了TSPAN9-/-小鼠中迁移体的形成。为直接检测中性粒细胞的迁移体形成速率，作者分离了野生型和TSPAN9-/-小鼠的中性粒细胞，用不同的颜色标记。将WT/TSPAN9-/-小鼠中性粒细胞的混合物注射至小鼠体内。结果发现，TSPAN9-/-中性粒细胞的迁移体形成显著减少。（4）为研究是否减少线粒体胞吐影响线粒体质量，作者从脾脏中分离中性粒细胞，然后检测其MMP。发现存在两种中性粒细胞群体，一类MMP较高，一类MMP较低。大多数WT组的大部分中性粒细胞属于高MMP细胞群；相反，尽管不同动物之间存在差异性，TSPAN9-/-小鼠中高MMP的中性粒细胞百分比显著减少。（5）为了阐明TSPAN9和迁移体在线粒体质控中的作用，作者检测了骨髓来源成熟中性粒细胞的MMP。中性粒细胞产生和成熟于骨髓，经较长距离迁移到达脾脏。作者推测，如果迁移体而非TSPAN9是维持线粒体质量所必需的，WT型和TSPAN9-/-小鼠的骨髓中性粒细胞与脾脏中性粒细胞相比，其MMP应该差异很小。因为，骨髓中性粒细胞尚未经历长距离迁移，因而线粒体胞吐还未生效。结果的确发现，两组骨髓中性粒细胞与脾脏中性粒细胞MMP几乎没有差异。这些数据说明，是迁移体而不是TSPAN9在线粒体质控中发挥作用。（5）最后，作者研究了中性粒细胞中受损线粒体的生理效应。已知不断积累的受损线粒体可修复细胞活力。因此，作者分别检测了WT型和TSPAN9-/-小鼠骨髓和脾脏来源成熟中性粒细胞的数量，结果发现WT型和TSPAN9-/-小鼠骨髓中性粒细胞的数量接近，提示在TSPAN9-/-小鼠中中性粒细胞的产生和成熟是正常的。然而，与WT相比，TSPAN9-/-小鼠脾脏中性粒细胞数量显著减少。为了直接检测中性粒细胞的活力，作者分离了WT型和TSPAN9-/-小鼠骨髓来源中性粒细胞，用不同剂量的CFSE标记，然后注射至WT小鼠体内。结果发现，1天后，WT中性粒细胞数量显著超过TSPAN9-/-组，说明线粒体胞吐的确有助于体循环中中性粒细胞的存活。