FSHW | 玫瑰花中黄酮类成分抑制人肝癌HepG2细胞增殖和转移

Introduction

恶性肿瘤一直是医学研究的难题，也是严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。肝癌作为世界上6种最常见的恶性肿瘤之一，具有仅次于肺癌的高死亡率和致残率。虽然目前临床治疗和药物治疗可以降低其发病率和死亡率，但化疗和抗肿瘤药物副作用强，会极大削弱患者自身的免疫调节能力。研究发现玫瑰提取物可以有效抑制白血病病毒、人类免疫缺陷病毒和T细胞白血病病毒。黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等生物活性，可以有效预防某些类型的癌症。

玫瑰是蔷薇科蔷薇属的一种药食两用植物。平阴玫瑰因其香甜、香气醇厚、香气浓郁、品质优良而被誉为中国传统玫瑰的代表。富含黄酮类化合物的玫瑰能够有效降低酒精对肝脏的毒性作用，具有良好的保肝作用。玫瑰的乙醇提取物对卵巢癌（TOV-112D）、宫颈癌（HeLa）、癌症（T47D）和肿瘤（A549）细胞株具有更好的抗肿瘤活性。此外，许多研究证实玫瑰水提物具有抗氧化、抗炎等许多生物活性。玫瑰中黄酮类成分具有广泛抗肿瘤的生物活性，被认为是主要的抗癌成分。

玫瑰中黄酮类成分对人肝癌细胞的作用机制尚不清楚。齐鲁工业大学的Zhiguo Zhang*、Shu Xing*等分别用蒸馏水（RFW）和70%乙醇（RFE）提取平阴玫瑰中黄酮类化合物，并测定其含量，研究玫瑰中黄酮类成分对人肝癌细胞株HepG2增殖和转移的影响。通过光学/荧光显微镜、MTT检测、Transwell分析、流式细胞术和Western blot实验检测玫瑰中黄酮类成分对HepG2细胞形态、凋亡和蛋白表达的影响。希望从药食同源的角度，为玫瑰抗肝癌的研究和应用提供理论依据。

Results and Discussion

玫瑰中黄酮类成分的含量

如图1所示，（A）为干燥的玫瑰花冠，（B）为RFW，（C）为RFE。绘制芦丁标准曲线，回归方程A = 0.011 5c + 0.008 8，相关系数R2 = 0.999 7，说明试验中选择的芦丁浓度与吸光度具有良好的线性关系。将RFW和RFE的吸光度代入标准曲线中，计算玫瑰中黄酮类成分的含量。如表1所示，蒸馏水和70%乙醇提取玫瑰中黄酮粗品得率分别为24.70%和28.34%。RFW含量为（47.82±0.152）mg RE/g, RFE含量为（79.08±0.195）mg RE/g。RFE含量是RFW的1.65倍。

图1 干玫瑰花冠（A）和玫瑰黄酮粗提物：RFW（B），RFE（C）

表1 不同提取阶段的玫瑰黄酮含量

玫瑰中黄酮类成分对肿瘤细胞增殖的抑制作用

MTT试验是目前检测细胞增殖和细胞活力最常规、最有效的方法。采用MTT法测定玫瑰中黄酮类成分酮对HepG2细胞生长的影响。图2显示了RFW和RFE分别刺激HepG2细胞24 h后对细胞生长的抑制作用。结果表明，不同溶剂提取的玫瑰中黄酮类成分对HepG2细胞的抑制作用呈剂量依赖性。剂量越大，细胞毒性越强。说明玫瑰中黄酮类成分具有良好的抗肿瘤作用，且RFE的抗肿瘤作用明显优于RFW。

图2 采用MTT法测定玫瑰中黄酮类成分对HepG2细胞的生长抑制作用

玫瑰中黄酮类成分对HepG2细胞形态变化的影响

正常过程中，贴壁细胞的生长会受到自身分泌或培养基中营养物质的刺激，通过细胞前附着因子在培养基表面扩散，并延伸至正常形态，当细胞受到外界条件的刺激时，其粘附会减弱。图3为玫瑰中黄酮类成分处理HepG2细胞24 h后细胞形态的变化。细胞形态观察进一步证实了MTT试验的结果，不同浓度的玫瑰黄酮对HepG2细胞的影响呈浓度依赖性。低浓度（10～40 μg/mL）的玫瑰黄酮可抑制HepG2细胞的生长，高浓度（80～160 μg/mL）的玫瑰黄酮可破坏细胞结构，促进细胞凋亡。RFE的效果略优于RFW，与甲氨蝶呤的效果相当。因此，我们使用低剂量和高剂量样本分别研究肿瘤细胞的转移和凋亡。

图3 RFW和RFE分别处理HpeG2细胞后，细胞形态发生变化

玫瑰中黄酮类成分对HepG2细胞迁移和侵袭的影响

创面愈合实验和Transwell细胞侵袭的体外实验表明，在10～40 μg/mL浓度范围内，玫瑰中黄酮类成分能有效抑制HepG2细胞的迁移和侵袭，其中RFE组明显优于RFW组（图4，图5）。先前有研究发现槲皮素和白藜芦醇对细胞转移有很好的抑制作用，这两种物质也是玫瑰黄酮中主要的苷元。

图4 玫瑰黄酮对HepG2细胞迁移实验的影响

图5 玫瑰黄酮对HepG2细胞侵袭能力的影响

玫瑰中黄酮类成分对肿瘤细胞凋亡的影响

细胞凋亡是一个连续的、不可逆的过程。该过程分为3个阶段：衍生阶段、效应阶段和降解阶段。以不同浓度的玫瑰黄酮处理HepG2细胞24 h，采用Annexin V-FITC和PI染色试剂盒检测早期和晚期凋亡细胞的比例。如图6所示，细胞凋亡结果表明，玫瑰中黄酮类成分可诱导HepG2细胞凋亡，且呈剂量依赖性。以160 μg/mL的相同浓度给药时，RFE的作用优于RFW，甚至优于甲氨蝶呤。研究发现，苹果黄酮类化合物对癌细胞的诱导作用具有抗肿瘤作用。与苹果黄酮相比，玫瑰黄酮具有更明显的抗肿瘤作用。玫瑰黄酮的抗肿瘤能力可能是由于诱导细胞产生ROS, ROS是诱导凋亡的关键介质，但具体机制有待进一步研究。综上所述，玫瑰中黄酮类成分作为抗癌药物具有较大的开发利用潜力。

图6 玫瑰黄酮对HepG2细胞凋亡的影响

玫瑰中黄酮类成分对HepG2细胞凋亡相关蛋白水平的调节作用

p53、Bcl-2和caspase家族是主要的相关凋亡基因。用玫瑰中黄酮类成分处理HepG2细胞24小时后，用Western-blot检测相关凋亡蛋白的表达。如图7所示，随着玫瑰黄酮浓度的增加，p53和Bax的表达水平逐渐上调，而Bcl-2、pro-caspase 3和pro-caspase 9的表达下调。玫瑰黄酮通过上调前凋亡蛋白p53和Bax的表达，下调pro-caspase 3和pro-caspase 9的水平，破坏HepG2细胞，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进caspase 3和caspase 9的释放。这些数据与凋亡实验的分析结果一致，进一步表明玫瑰中黄酮类成分可诱导HepG2细胞凋亡。

图7 玫瑰黄酮对HepG2细胞免疫印迹的影响

Conclusion

综上所述，本研究表明，玫瑰中黄酮类成分通过抑制肿瘤细胞生长和减少细胞附着而具有显著的抗肿瘤活性。低浓度的黄酮（10～40 μg/mL）对He-pG2细胞的迁移和侵袭具有较好的抑制作用，且呈剂量依赖性，而高浓度的黄酮（80～160 μg/mL）可以破坏HepG2细胞形态，可通过上调促凋亡蛋白p53和Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，诱导HepG2细胞凋亡。在相同浓度下，RFE的效果明显优于RFW。本研究发现玫瑰中黄酮类成分对人肝癌细胞HepG2的增殖和转移具有一定的抑制作用，希望从药食同源的角度，为玫瑰抗肝癌的研究和应用提供理论依据。

Flavonoids of Rosa rugosa Thunb. inhibit tumor proliferation and metastasis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

Zhiguo Zhanga,*, Meilin Wanga, Shu Xingb,*, Chen Zhangc

a School of Food Science and Engineering, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250353, China

b School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250353, China

c School of Science, The Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong, China

*Corresponding author.

E-mail address: zzg@qlu.edu.cn

shuxingcareer@hotmail.com

Abstract

Rosa rugosa Thunb. is recognized as both medicine and edible in China. The article investigated the antitumor activity of rose flavonoids. Water-extracted rose flavonoids (RFW) and ethanol-extracted rose flavonoids (RFE) were achieved by extracting with distilled water and 70% ethanol, respectively. The effects of the two extracts on proliferation inhibition, apoptosis inducement and metastasis prevention of human HepG2 hepatocellular carcinoma cell lines were tested, via optical/fluorescence microscopy, MTT detection, Transwell assay, flow cytometry and Western blot, etc. The results indicated that rose flavonoids at low concentration (10–40 μg/mL) had a better inhibitory effect on migration and invasion of HepG2 cells in a dose-dependent manner, while rose flavonoids at high concentration (80–160 μg/mL) could induce apoptosis of HepG2 cells by up-regulating the expression of pro-apoptotic proteins p53 and Bax, and down-regulating the expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2, leading to the functioning of caspase-3 and caspase-9. The effect of RFE at the same concentration was significantly better than that of RFW. Conclusion, this study found that rose flavonoids had a certain inhibitory effect on proliferation and metastasis of human liver cancer cells HepG2, indicating the application of rose flavonoids in preventing and treating of liver cancer.

Reference:

ZHANG Z G, WANG M L, XING S, et al. Flavonoids of Rosa rugosa Thunb. inhibit tumor proliferation and metastasis in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(2): 374-382. DOI:10.1016/j.fshw.2021.11.016.

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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