新发传染病的暴发已成为全球面临的严峻挑战，因此探索具有多种机制的新型广谱抗病毒药物是目前研究的重点。
近日，中山大学公共卫生学院（深圳）孙彩军团队在kynurenine -3--monooxygenase(KMO)抑制病毒感染的机制上取得重要进展，相关研究成果以“Kynurenine-3-monooxygenase (KMO) broadly inhibits viral infections via triggering NMDAR/Ca2+ influx and CaMKII/ IRF3-mediated IFN-βproduction”为题，发表在《PLOS Pathogens》杂志。该研究发现KMO通过触发NMDAR/ Ca2+内流和CaMKII/ IRF-3介导的IFN-β产生广泛地抑制病毒复制。
众所周知，通过犬尿氨酸途径(KP)代谢色氨酸(Trp)在癌症、自身免疫和神经退行性疾病中发挥重要作用。然而，它在宿主-病原体相互作用中的作用尚未被确定。该团队研究表明，KP的关键限速酶KMO和KMO酶的关键酶解产物喹啉酸(QUIN)对多种病毒具有抗病毒作用。在机制上，QUIN通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)和Ca2+内流激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶II (CaMKII)/干扰素调节因子3 (IRF3)诱导I型干扰素(IFN-I)的产生。重要的是，QUIN治疗能有效抑制病毒感染，缓解小鼠疾病进程。此外，KMO敲除小鼠易受致病性病毒攻击，临床症状严重。总的来说，作为色氨酸代谢中的关键限速酶，KMO及其酶促产物QUIN有望成为一种新型的广谱抗病毒因子，是潜在的治疗新出现的致病病毒的抗病毒靶点。
首先，他们证明KMO是一种干扰素依赖基因。用重组HSV-GFP-Luc报告病毒筛选了288个IFN-α和IFN-γ诱导的干扰素刺激基因（ISGs），以此鉴定出已知的抗病毒基因包括IRF1、CH25H、IFITM2、TAP1、LY6E以及一些新的抗病毒基因，包括KMO、SERPINA5、SLFN12、GPR146和LIPG。接着，他们用不同toll样受体(TLRs)激动剂（如LPS、poly(I:C)、R848）刺激Raw264.7和WT-J2-BMM细胞可显著下调KMO表达，相反，IFN-α刺激Raw264.7和WT-J2-BMM细胞可显著诱导KMO表达。更重要的是，在Raw264.7细胞中，HSV-1感染后KMO的表达均呈剂量依赖性和时间依赖性，从而证明了KMO的表达是干扰素诱导的。
接下来，他们研究了KMO潜在的抗病毒活性。通过定量PCR分析，发现KMO的过表达显著抑制了HSV-1的复制，并且Western Blotting分析和空斑分析进一步证实了这种抑制作用。为了进一步验证KMO的抗病毒功能，分别使用小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)和短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)有效抑制KMO的表达。结果表明，与野生型细胞相比，KMO-knockdown细胞中HSV-1的复制显著增强。此外，通过构建kmo-/-细胞株发现与野生型(WT)细胞相比，kmo-/-细胞中HSV-1的复制显著增强，KMO基因的补充可以有效地拯救kmo-/-细胞的抗病毒活性。
基于以上研究结果，他们继续探讨了KMO的抗病毒功能是否依赖于其酶活性。已有研究表明，Tyr 99、Tyr 194和Glu 366残基对KMO的酶活性至关重要。因此，通过定点诱变构建了一系列KMO突变体(kmo - m1 -3)。结果显示，与野生型KMO相比，这些KMO酶无功能突变体过表达对HSV-1感染没有明显的抑制作用，提示KMO的酶活性是其抗病毒功能所必需的。随后，又评估了KMO处理过的细胞培养上清液中的酶产物是否发挥了病毒抑制作用。正如预期的那样，KMO处理细胞的上清液显著抑制Vero细胞和293T细胞的HSV-1感染， Western Blotting分析进一步证实了这一观察，表明KMO通过产生潜在的可溶性抗病毒因子发挥抗病毒功能。由此，通过实验发现了KMO通过其酶促产物QUIN发挥抗病毒作用。
随后，研究了KMO和QUIN在HSV-1感染细胞中抗病毒功能的潜在机制。对HSV -1感染的RAW264.7细胞进行了RNA-seq、GO以及KEGG分析显示，QUIN和KMO可能通过调控IFN-I的产生及相关信号通路等途径发挥抗病毒作用。在Raw 264.7细胞中过表达KMO显著诱导了IFN-β的表达水平进一步验证了生信分析结果。相反，siRNA或shrna介导的KMO沉默表达和CRISPR/ cas9介导的KMO敲除显著降低了IFN-β的表达水平。并且，KMO酶活性抑制剂R061-8048也能以剂量依赖性的方式抑制IFN-β的产生。此外，QUIN处理以剂量依赖的方式显著诱导IFN-β的产生。这些数据表明诱导干扰素的产生可能有助于KMO和QUIN的抗病毒活性。
然后，继续研究了KMO/ quin诱导的HSV感染细胞中IFN-β产生的信号通路，发现KMO过表达有效地激活了IRF3 Ser396位点的磷酸化(pSer396)。同时，QUIN对IRF3磷酸化的激活也有类似的作用，且呈剂量依赖性。相反，KMO敲除显著降低了HSV感染细胞中IRF3的磷酸化，从而增加了HSV-1 ICP27蛋白的表达。此外，KMO抑制剂R061-8048在HSV-1感染反应中也抑制了IRF3的磷酸化。总之，这些数据表明KMO/QUIN通过增强HSV感染细胞的IRF3磷酸化来促进IFN-β的产生。
之后，研究人员探究了KMO/QUIN如何调控IRF3磷酸化。此前有报道称QUIN是NMDAR的一种激动剂，可诱导Ca2+内流。在研究中，他们首先验证了NMDAR在不同细胞系中的表达，然后确定了QUIN是否可以诱导Ca2+内流。使用Calbryte 520直观地标记细胞内Ca2+，在Raw 264.7细胞中观察到在QUIN刺激后细胞内Ca2+立即增加，而(-)- mk -801处理的样品中Ca2+内流的增加被显著抑制(图3K)，这是一种NMAR抑制剂。考虑到Ca2+内流增加可以通过钙/钙调素依赖性蛋白激酶II (CaMKII)和IRF3信号通路触发IFN-I的产生，研究人员进一步确定KMO/QUIN是否调节CaMKII的磷酸化。结果显示，在HSV-1感染的细胞中，KMO过表达增强，而KMO敲除降低CaMKII磷酸化(T286)(图3L)。同样，在QUIN孵育后CaMKII磷酸化(T286)也增加了。相反，在KMO抑制剂(Ro 61 8048)(图3N)、(-)- MK -801(图3O)或siCaMKII的存在下，QUIN诱导的CaMKII磷酸化被显著抑制。他们已经证明了CaMKII和IRF3在quin刺激的细胞中以剂量依赖性的方式直接相互作用(图3Q)。综上所述，KMO/QUIN通过激活NMDAR/Ca2+内流来触发CaMKII/IRF3信号通路，从而诱导IFN-I的产生。
KMO和QUIN具有广泛的抗病毒活性。由于KMO通过增强IFN-I诱导而具有对抗病毒感染的新功能，所以研究人员继续探究了KMO抗病毒活性的广度。他们的研究结果表明，KMO能有效抑制DNA病毒的复制，如HSV-1(一种包膜DNA病毒)和腺病毒(一种非包膜DNA病毒)，并呈剂量依赖性。此外，KMO对RNA病毒也有显著的抗病毒作用，如负链RNA病毒，包括水泡性口炎病毒(VSV)和流感病毒(PR8)，正链RNA病毒，包括寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)和SARS-CoV-2。
QUIN治疗可保护小鼠免受病毒感染。接下来，研究人员研究QUIN作为一种潜在的抗病毒药物在体内对抗病毒感染的效力。小鼠感染高致病性HSV-1 McKrae株后，每天给予QUIN治疗7天，并且使用控制疱疹感染的无环鸟苷(ACV)作为阳性对照。在感染后7 d (dpi.)，对照组小鼠角膜瘢痕和视力损害明显恶化，而QUIN组和ACV组角膜瘢痕和视力损害明显减轻。更重要的是，当受到高致病性的HSV-1 McKrae株攻击时，QUIN有效地保护了小鼠，并显著提高了它们的存活率。此外，quinin处理的小鼠洗眼液中的病毒拷贝数显著低于空白对照组的小鼠。他们还定量测量了这些实验小鼠的血清、脑和脾脏中IFN-β的浓度，发现使用quin处理的小鼠比空白对照的小鼠的IFN-β分泌显著增加。而且，通过酶联免疫吸附点(ELISPOT)检测，与对照组相比，QUIN组中HSV-1抗原特异性IFN-γ分泌细胞的频率增加，这意味着QUIN治疗也调节了适应性免疫应答。特别是抗原特异性细胞免疫反应。总的来说，这些数据表明，QUIN治疗有效地保护小鼠免受病毒感染。
Kmo -/-小鼠更容易受到病毒感染。最后,确定KMO在宿主防御病毒感染中发挥生理作用。对基因敲除小鼠进行攻毒实验并且对攻毒后的生理指标进行一系列评价如下图结果所示。总之，这些发现表明在生理上，KMO是参与调节抗病毒免疫的关键抗病毒因子。
探索新型抗病毒药物来应对新发传染病是公共卫生领域的重点，在未来的研究中，进一步研究KMO和QUIN作为候选抗病毒药物的可能性是非常有意义的，该项研究首次明确了KMO在先天免疫中的调节作用，发现了崭新的抗病毒药物靶点，尤其是在抗新冠病毒药物筛选上更值得进一步探索。
中山大学公共卫生学院（深圳）18级博士生赵锦为本文的第一作者，孙彩军教授与程根红教授为论文的通讯作者。文章链接 https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1010366)
来源：公众号Immunity Advances
编辑/孙琳
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