Neuron：神经元线粒体自噬新机制

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PTEN诱导的激酶1(PINK1)是通过Parkin易位和线粒体自噬去除受损线粒体所需的短寿命蛋白质。由于PINK1的短半衰期限制了其被转运到神经突中的能力，因此这种线粒体自噬途径需要在远离胞体的地方进行局部翻译。PINK1转录本与神经元线粒体结合并共同运输。

在翻译过程中，线粒体外膜蛋白synaptojanin 2结合蛋白（SYNJ2BP）和synaptojanin 2（SYNJ2）是通过SYNJ2中的RNA结合域将Pink1 mRNA与线粒体结合所必需的。这种对PINK1局部翻译的神经元特异性适应为远端线粒体提供了持续供应的PINK1，以激活线粒体自噬。

为了确定PINK1在哺乳动物神经元中的半衰期，作者检测了内源性PINK1在人IPSC来源的神经元中的稳定和清除（图1A，1B）。抗霉素A使Parkin与线粒体共存的比例从~10%增加到29%（图1C，1D)。

在添加抗霉素A前4小时将放线菌酮（CHX）应用于轴突小室可消除80%的这种增加（图1D），而将CHX添加到胞体小室的效果明显较差。因此，局部翻译有助于诱导轴突中依赖于Parkin的线粒体自噬。

作者还测定了PINK1转录本和已知的胞体限制性RNA γ-actin的相对丰度，并将其归一化为线粒体rRNA的数量。虽然γ-actin很少，但PINK1 mRNA很容易在轴突部分检测到（图1E）。外源性PINK1 mRNA被发现转运到视神经，而对照的GFP转录本在轴突中几乎不存在（图1F）。

图1

RNAScope原位杂交显示，内源性PINK1 mRNA出现在与线粒体蛋白ATP5a共存的轴突和树突上(图2A)。STED成像将PINK1 mRNA信号分解为每个线粒体上的多个小斑点。相反，β-actin mRNA几乎不与线粒体重叠(图2B)。

为了在神经元中实时成像PINK1 mRNA，作者使用了MS2/PP7-splitVenus方法（图2C）。为了排除轴突线粒体的相对频率会随机产生相同的重叠，作者翻转了拉直图像的线粒体通道。

原始图像中的共定位程度明显高于翻转对照（图2E-2G），且在胞体和树突中的重叠也明显高于其相应的翻转图像（图2F，2G）。

图2

作者分析了mRNA在树突中的运输，大多数PINK1 mRNA颗粒及其相关线粒体是静止的（图3A)。在观察期间，mRNA和线粒体在树突和轴突中都保持在一起，89%的PINK1 mRNA与线粒体同步运动。这意味着线粒体和PINK1mRNA之间存在着持续的联系，甚至在神经元的外围也是如此。

作者还比较了编码野生型（WT）和非活性PINK1 K219M的mRNA的运动性（图3D）。正如预期的那样，PINK1 mRNA转运到线粒体的偶联过程中，与表达PINK1 K219M相比，表达WT型PINK1蛋白时PINK1 mRNA颗粒运动的时间减少了60%。

图3

为了确定PINK1 mRNA与线粒体连接的机制，作者展示了融合到BFP编码序列的mRNA的缩减版本（图4）。尽管许多RNA结合蛋白（RBPs）结合在非翻译区(UTR)中，但PINK1的UTR都不足以诱导BFP转录本的线粒体定位，也不足以诱导PINK1的C末端部分和3’UTR的组合（图4A)。

然而，将PINK1的N端部分包含在5’UTR中，足以将mRNA定位到胞体、轴突和树突中的线粒体（图4A，4B)。孵育1h后，全长PINK1 mRNA已从线粒体移位到胞浆中（图4C)。同样，缺少起始密码子的结构不能定位于线粒体（图4A，4D）。

作者还展示了一个由PINK1与BFP融合的5’UTR和MTS组成的结构（PINK1 5’UTR+MTS-BFP）。尽管BFP融合蛋白定位于线粒体，但嵌合的PINK1/BFP转录本仍然存在于胞质（图4E)。

图4

在神经元中SYNJ2BP被敲除后，作者发现PINK1 mRNA与神经元胞体中的线粒体和树突中的mRNA的结合较少（图5A，5B），这可能是由于mRNA的运输减少所致。具有shRNA抗性的SYNJ2BP表达挽救了这些效应（图5B）。

PINK1 mRNA在胞体中形成了更大的聚集体并与RFP-DDX6共定位，而RFP-DDX6是加工小体的标记（图5C）。与Pink1 mRNA转运所需一致，SYNJ2BP的低表达降低了抗霉素A诱导的远端轴突线粒体自噬的发生率（图5D）。在抗霉素A处理神经突中观察到的线粒体磷酸泛素增加被SYNJ2BP敲低所消除（图5E，5F）。

图5

PINK1 mRNA在非神经细胞，包括COS-7、HeLa细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的线粒体上不表达（图6A)。在海马培养中，Synj2a转录水平是成纤维细胞的5倍（图6B），而ER蛋白核糖体结合蛋白1（RRBP1）转录水平在成纤维细胞中是成纤维细胞的7倍（图6C）。

同样，SYNJ2蛋白在神经元中比在成纤维细胞中更丰富，而RRBP1则相反(图6D)。在COS-7细胞中过表达SYNJ2a和SYNJ2BP使PINK1 mRNA重新定位到线粒体（图6E，6F）。

图6

作者在HEK细胞中使用254 nm紫外交联和免疫沉淀（CLIP）表达了SYNJ2的myctagged RRM结构域。在SYNJ2mito VQL/AAA表达后，Pink1 mRNA停留在胞质中（图7B，7C）。在HEK细胞中表达了SYNJ2mito WT或VQL/AAA突变体，并通过RNA-seq鉴定了相关的转录本（图7D）。

图7

总 结

Harbauer等人描述神经元中PINK1 mRNA与线粒体共转运。短命线粒体蛋白的转录本与其靶细胞器的运动偶联确保了细胞远端受损线粒体依赖PINK1降解的功能。

参考文献

Angelika B. Harbauer, Simone Wanderoy, J. Tabitha Hees, Whitney Gibbs, Martha Ordonez, Zerong Cai, Romain Cartoni, Ghazaleh Ashrafi, Chen Wang, Zhigang He, Thomas L. Schwarz. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via Synaptojanin 2 to support local mitophagy. bioRxiv 2021.05.19.444778; doi: https://doi.org/10.1101/2021.05.19.444778

编译作者：Leo Ray（brainnews创作团队）

校审：Simon（brainnews编辑部）