FSHW | PROTAC策略赋能天然产物作用靶点的鉴定

Introduction

目前，已经有很多天然产物的生物活性的报道，这些报道虽然大多都是基于细胞水平与动物水平的研究结果，但是，对天然产物与靶标蛋白相互作用的研究相对较少。蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）技术是基于蛋白泛素化降解策略，利用生物活性分子与其靶蛋白（TAP）的结合，经过泛素-蛋白酶系统对体内蛋白质降解的一种新的靶标蛋白降解策略（图1）。PROTAC单元对靶标蛋白的泛素化降解，将为天然产物靶标蛋白的鉴定与利用，提供一种新的策略。 中南林业科技大学杨谷良副教授，黄冈师范学院李士明教授*和中国林业科学研究院齐志文博士*等综述了PROTAC技术的进展、阐述了其在天然产物作用靶标的应用。

图1 PROTAC降解TAP的机理

Results and discussion

PROTAC技术的优势

目前已鉴定的致病天然蛋白有3 000多个，其中只有大约400 个具有药物靶向性。由于缺乏小分子结合位点或靶蛋白的活性阻断位点，大多致病蛋白都被认为是“不可成药性蛋白”。例如，Tau蛋白聚集与神经退行性疾病有关，但是，目前还没有发现具有阻断该蛋白的聚集，从而减轻神经退行性变化的药物。与传统的小分子化合物的阻断治疗相比，PROTAC策略具有一系列优势：首先，因为PROTACs只需要结合在TAP的任意位点，而不需要占据或阻断TAP的活性位点。与TAP结合后，TAP将通过泛素化途径被降解。因此，一些没有传统药物或抑制剂结合位点的蛋白质，可以被PROTACs以泛素化途径降解。此外，PROTACs对TAP的降解效率与其和TAP的亲和度之间没有直接关系；其次，在TAP被泛素化后，PROTACs单元将被释放并重新结合到新的靶蛋白上，导致其泛素化。因此，PROTAC的泛素化依赖性降解，可以解决传统药物的使用浓度较高的不足；第三，PROTAC策略可以应对传统药物副作用大的问题。大多数蛋白质家族包含许多结构高度相似的亚型，但不同亚型在不同疾病中的功能和表达水平各不相同。因此，如果随机使用非特异性抑制剂，将导致严重的毒性作用。所以，如果以能够与特定构型的TAP结合的小分子构建PROTAC，就可以实现对TAP的选择性降解。如：靶向降解RIPK和BRD4的PROTACs，已被制备成为了高选择性抑制剂，对特定亚型的RIPK和BRD4的降解具有很高的特异性。因此，作为一种治疗策略，PROTACs具有很好的应用前景，特别是对于“不可成药性蛋白”的降解。

PROTAC技术存在的问题

虽然PROTACs具有很好的靶向降解活性。但是，PROTAC的相对分子质量通常超过1 000 Da，超高分子量导致其药代动力学性能较差，给药后难以被吸收。更为重要的是，PROTAC的脱靶概率已经成为最大的担忧之一。例如，由bestatin和全反式维甲酸（ATRAs）等构建的PROTACs，不仅能降解维甲酸受体，还能诱导AR和ER的降解。因此，在设计PROTAC时，小分子化合物的靶向结合活性是另一个必须注意的问题。此外，某些蛋白质在一定水平上的表达有助于维持体内基本的生理活动。TAP的过度降解，可能会影响机体的正常生理活动。因此，在设计PROTAC单元时，应综合考虑其体内吸收利用效率、靶点特异性，以及在实际使用时的适当浓度等，以最大限度地提高其利用效率，降低其潜在的毒性效应。

生物活性小分子的PROTAC设计

PROTAC单元由TAP、L-UBL-E3和接头分子等组成。这3 个分子中，任何一个的变化都会导致PROTAC的活性发生显著变化。因此，在设计PROTACs单元时，需要筛选出最佳的TAP配体、不同类型的E3连接酶配体、以及对接头分子的组成、长度、结合位点等进行优化。

已经应用于PROTAC合成的E3连接酶主要有：mouse double minute 2 homologue (MDM2)、cellular inhibitor of apoptosis protein-1 (cIAP1)、cereblon、von Hippel-Lindau (VHL)等。针对于这些E3连接酶，目前，只有少数的E3连接酶配体成功应用于PROTAC单元的构建（图2）。

图2 用于PROTAC单元构建的主要E3连接酶配体

目前，已有大量的小分子化合物被用为PROTAC单元中靶标蛋白的配体。包括：nutlin和MeBS等，并表现出很好的降解靶标蛋白的活性。

除了筛选E3连接酶配体、接头分子和靶蛋白配体外，在PROTAC单元的设计中，出现了一些新的策略，如：具有不同长度接头分子的PROTAC library、Homo PROTAC和Photo-PROTAC等（图3），这些新的策略的出现，减轻了PROTAC单元设计与合成的工作量、提高了其对靶蛋白的降解效率等。

图3 新的PROTACs单元及其降解策略

天然产物的TAP

当前，PROTAC策略主要应用于药物小分子的化学改性。在天然产物上的应用相对较少。对于大多天然小分子化合物，分子结构中具有含有羟基或氨基等结构，具有制备成PROTAC分子的可能性。熊果酸（UA）是一种在很多植物中都广泛分布的一种天然三萜类化合物。为了验证其靶向结合蛋白，在先前的研究中，我们分别将UA、MDM2配体和不同接头分子连接，制备了6 种UA-PROTAC化合物。结果表明，化合物1B具有显著的体外抗肿瘤活性（对A549、Huh7、HepG2的IC 50 值为0.23～0.39 μmol/L）。WB结果表明，经化合物1B处理后，MDM2被显著降解，并促进了MDM2下游P21和PUMA蛋白的表达，从而抑制A549细胞的增殖，促进了凋亡。因此，在理论上，PROTAC技术可以应用于大多数具有生物活性的天然产物中。

Conclusion

小分子PROTAC的出现，引起了人们的广泛关注，越来越多的“不可成药性蛋白”被成功地降解。总的来说，PROTAC策略有望成为一种新的靶点识别方法。由于PROTAC技术的形成时间较短，目前，PROTAC在天然产物靶蛋白鉴定中的应用报道较少。经过多年的发展，PROTAC单元间的构效关系（SAR）和TAPs的泛素化降解已经取得了很大的进展。此外，PROTAC library等新策略的出现，大大减少了PROTAC应用中SAR的筛选。因此，基于PROTAC策略的天然产物TAP的识别，具有良好的应用前景。

Potential application of proteolysis targeting chimera (PROTAC) modification technology in natural products for their targeted protein degradation

Guliang Yanga, Haiyan Zhonga, Xinxin Xiaa, Zhiwen Qib,*, Chengzhang Wangb, Shiming Lic,*

a National Engineering Laboratory for Rice and By-products Processing, Food Science and Engineering College, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China

b Institute of Chemical Industry of Forest Products, CAF, Nanjing 210042, China

c Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, China

*Corresponding author.

E-mail address: zhiwenqi89@163.com; shiming@rutgers.edu

Abstract

There are numerous evaluations of natural products, of which majority are food bioactives, performed up to date for their various health beneficial activities via targeting specific proteins. However, the direct identification of a targeted protein remains unexplored for natural occurring compounds. Proteolysis targeting chimera (PROTAC) is a type of bifunctional chimeric molecules that can directly degrade the binding proteins targeted by bioactive molecules in an ubiquitin-proteasome pathway. As the agents in protein degradation dependent on ubiquitin ligase, the bifunctional molecule connects the target protein ligand and E3 ligase ligand together via an appropriate linker. It is highly selective and efficient to induce the ubiquitin-mediated degradation of targeted binding proteins. Therefore, it has been demonstrated that the PROTAC technology has broad application in the modulation of the target protein level. In this review, we outlined the advances in PROTAC combined molecule compounds, summarized its quantitative structure-activity relationship, and finally reviewed the methods applied in identifying the target proteins of natural products. We hope it will provide an insightful application of PROTAC techniques in the target protein identification of natural products including food bioactive molecules.

Reference:

YANG G L, ZHONG H Y, XIA X X, et al. Potential application of proteolysis targeting chimera (PROTAC) modification technology in natural products for their targeted protein degradation[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(2): 199-207. DOI:10.1016/j.fshw.2021.11.001

编辑：王佳红；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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