摘要
与化学固定相比，冷冻固定已被证明是有效保存天然细胞超微结构的黄金标准，但由于实施方面的挑战，这种方法并未广泛用于荧光显微镜。最近，科研人员开发了 Cryo-ExM（冷冻固定-扩展显微镜），这是一种通过将冷冻固定与扩展显微镜相结合来保留天然细胞组织的方法。这种方法绕过了与化学固定相关的伪影，其简单性将有助于其在超分辨率显微镜中的广泛使用。
图 1：冷冻与化学固定中的细胞结构保存。
将冷冻固定与膨胀显微镜相结合
为了开发 Cryo-ExM，科研人员利用了著名的 EM 冷冻固定方法，然后进行冷冻替代，该方法包括在聚合之前将玻璃化标本嵌入树脂中，然后进行 EM 研究处理。这种方法可以保存高水平的细胞结构，并且远远超过化学固定。他们推断EM树脂可以被膨胀显微镜水凝胶代替（图1a）。为此，首先使用传统的快速浸入液体乙烷-丙烷中将生长在玻璃盖玻片上的生物样品冷冻固定以形成玻璃冰，如冷冻-FIB 研磨研究中所使用的。然后，将玻璃化的盖玻片在用液氮 (-180 °C) 预冷的丙酮中孵育，然后放在干冰 (-80 °C) 上过夜，使干冰蒸发，样品温度从 -180 °C 逐渐升高到0 °C。在此步骤中，样品中的水会慢慢被丙酮取代，这是确保正确细胞结构保存的关键过程。样品接下来用与越来越多的水混合的连续乙醇浴进行再水化，并使用 U-ExM 协议进行 ExM 水凝胶包埋。
图 2：Cryo-ExM 可以捕获精细的膜基结构。
图 3：Cryo-ExM 保留了细胞骨架元素。
相关论文以题为Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM)发表在《Nature Methods》上。通讯作者是日内瓦大学Virginie Hamel，和Paul Guichard教授。
参考文献：
doi.org/10.1038/s41592-021-01356-4
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