FSHW | 丰富的肠道共栖菌Faeciroseburia有助于灵芝杂萜衍生物的抗代谢紊乱作用

Introduction

肠道菌群研究的最新进展揭示了肠道菌群失调与人类疾病之间的密切关系。相对于人们在肠道细菌系统发育和基因组方面所积累的知识，我们对目前所鉴定的大多数物种的生理功能和代谢特征知之甚少。

丁酸盐是结肠细胞的能量来源，其可以通过激活G蛋白偶联受体（GPR41、GPR43、GPR109A）维持肠道屏障和完整性，是抗炎作用的关键介质。毛螺菌科和瘤胃菌科的丁酸产生菌已被证明在维持宿主健康方面发挥有益作用，包括抑制肥胖、炎症和糖尿病。例如，罗氏菌属可以在在ApoE-小鼠中降低内毒素血症和动脉粥样硬化，丁酸梭状芽孢杆菌诱导肠白介素（IL）-10产生的巨噬细胞可以抑制小鼠结肠炎，丁酸梭杆菌能够调节肥胖小鼠的中脂质分布、胰岛素抵抗和结肠稳态。

在之前的研究中，中国科学院微生物研究所的Shanshan Qiao、Shuangjiang Liu*、Hongwei Liu*等报道了一种合成的灵芝杂萜衍生物（GMD），其在ob小鼠中表现出多种代谢益处，包括延缓体质量增加，减少代谢性内毒素血症，降低血糖、血脂和延缓肝脂肪变性。因此，该团队为了识别与GMD治疗作用相关的共生菌，培养了来自GMD治疗小鼠和未治疗小鼠的肠道细菌。与来自未经处理的小鼠的分离株相比，发现Faeciroseburia intestinalis仅在GMD处理的小鼠中富集。F. intestinalis被确定为毛螺菌科的新成员，但其对宿主的生理作用尚不清楚。该团队在本研究中证明了F. intestinalis可降低炎症标志物的表达水平，能够降低血糖、血脂，改善肠道屏障功能，并证明了产生丁酸盐的细菌与GMD治疗效果之间的因果关系。

Results and Discussion

GMD可使肠道F. intestinalis富集

为了确定介导GMD对小鼠肠道有益作用的关键共生菌，本研究在厌氧条件下使用YCFA培养基培养GMD处理的小鼠肠道细菌，将所有分离株的近全长16S序列与小鼠肠道微生物生物库中的序列进行比较，结果从GMD治疗的小鼠中获得11个分离株（GMD-1～GMD-11）聚集成毛螺菌科的一个一致亚群（图1A）。分离株GMD-1～GMD-11与小鼠肠道微生物库中表征的F. intestinalis序列具有99%以上的序列一致性。透射电镜表征显示，F. intestinalis细胞大小约为0.4～0.5 μm × 4～20 μm（图1B）。对GMD处理小鼠的 Hiseq 测序数据的分析表明，一个可操作的分类单元（OTU）与F. intestinalis的序列同源性超过99%。Hiseq数据还表明，经GMD处理小鼠的F. intestinalis丰度增加了1.5倍。此外还发现，在体外培养中，GMD增加了GMD-1菌株（F. intestinalis的一种代表性菌株）的生物量（图1C）。

本研究接下来计算了从GMD处理小鼠的Hiseq结果中获得每个OTU的Spearman相关矩阵，并在Spearman相关矩阵和P值矩阵的基础上构建了细菌共表达网络。GMD-1与毛螺菌科的11个OUT（其中9个未分类）以及瘤胃球菌科的1个OTU建立了关联关系（图1D，1E）。另外，研究人员还发现F. intestinalis菌株丰度与潜在的促炎菌Alistipes和Prevotella丰度呈负相关。

F. intestinalis菌株的系统发育与Roseburia faecis菌最为接近。R. faecis和F. intestinalis 16S rRNA基因同源性达91%，DNA中G+C含量差异2.4%。对来自Twins UK（＞2000个体）和American Gut Project（＞6000个体）数据库中的宏基因组学数据的分析表明，16S rRNA序列＞99%的F. intestinalis确实是存在于人类体内（图1F），但其出现概率极低（约10个个体），而且相对丰度也偏低（每个样本1～2次读数）。这些证据表明，F. intestinalis菌与GMD介导效应有关。

图1 通过GMD在ob小鼠中富集丁酸盐产生菌F. intestinalis

F. intestinalis丁酸盐通路的基因组数据挖掘及短链脂肪酸（SCFA）产生的实验证明

肠道微生物衍生的代谢物在维持肠道稳态和介导肠道微生物组与宿主间的相互作用中起关键性作用。由于具有产生丁酸盐的潜力，毛螺菌科中的肠道细菌被认为对宿主代谢具有有益作用。作为毛螺菌科的新成员，对F. intestinalis的基因组进行了测序并分析了其丁酸盐的生产能力。如图1F所示，根据KEGG的通路分析，发现F. intestinalis拥有一条几乎完整的微生物丁酸盐产生途径，仅有一个酶模块的缺失。但F. intestinalis可以维持一个完整的糖酵解模块（M0001），由10个代谢步骤组成。虽然在F. intestinalis的基因组中不存在巴豆酰辅酶A还原酶，但有丁酰辅酶A–乙酸辅酶A转移酶（K18122）和丁酸激酶（K00625）两个关键酶，并在基因组中被注释。

F. intestinalis改善ob/ob小鼠的高血糖和高血脂症

为进一步证实F. intestinalis的生理作用，本研究分别采用活F. intestinalis（LFI）和热死的F. intestinalis（KFI）灌胃ob/ob小鼠。与对照组相比，经LFI治疗的ob/ob小鼠在体质量增加上减少86.2%（图2A），累积食物摄入量减少24.8%（图2B），指数减少5.6%（图2C），HbA1c水平降低12.5%（图2D），血浆游离脂肪酸水平降低25.2%、甘油三酯水平降低3.7%，胆固醇水平降低21.1%，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低了39.2%（图2E～2G）。此外，F. intestinalis使ISI增加了66.6%（图2J）。LFI还降低了肝损伤标志物（天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT））活性（图2K，2L），并改善了肝脏空泡化和脂质沉积，如H&E和油红染色所示（图2M）。KFI治疗组在体质量增加、LEE指数、口服葡萄糖耐量试验以及血浆葡萄糖、甘油三酯和胆固醇水平方面几乎没有改善。然而，KFI治疗减少了13.2%的食物摄入量，使ISI增加到与LFI相似的水平，使血浆游离脂肪酸、AST和ALT水平降低，与LFI相比，对肝脂肪变性的改善较少。KFI所观察到的改善现象可能来自于F. intestinalis的细胞成分。总的来说，口服LFI能有效降低ob/ob小鼠的高血糖和高脂血症。

图2 菌株F. intestinalis灌胃反映GMD对ob/ob小鼠的影响

F. intestinalis可帮助治疗ob/ob小鼠的代谢性内毒素血症并恢复肠道屏障完整性

肠道菌群失调在很大程度上导致了许多疾病的发生和发展，包括心血管疾病、肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病和肠易激综合征。与GMD治疗类似，灌胃LFI可降低ob/ob小鼠的LPS和TNF-α水平（图3A～3C），这表明代谢性内毒素血症症状的缓解。由于血浆LPS直接来源于革兰氏阴性肠道细菌，可以增加肠道通透性，因此，本文还研究了LFI对ob/ob小鼠肠道黏膜屏障功能的影响。结果表明，LFI提高了回肠黏膜完整性蛋白（MUC-1和MUC-5）和紧密连接蛋白（ZO-1和Occludin）的mRNA表达（图3D），这也反映在了回肠黏膜屏障改善（图3E）的PAS染色切片上。口服LFI或GMD显著提高了肠道中丙酸盐和丁酸盐的产生，通过测量小鼠粪便中的SCFAs证实了这一点（图3F，3G）。研究发现LFI处理上调了上皮性结肠细胞中PPAR-γ的mRNA表达，下调了诱导型一氧化氮合酶基因Nos2的mRNA表达（图3H，3I）。在GMD处理组和LFI处理组的结肠腔中检测到硝酸盐的减少（图3J）。

图3 F. intestinalis改善ob/ob小鼠的肠粘膜屏障功能

接下来，本研究对经F. intestinalis处理和载体处理的ob/ob小鼠的肠道微生物组进行了测序。整体肠道微生物组的F. intestinalis组与载体组显著不同，如非计量多维标度（NMDS）分析所示（图4A）。

与载体处理组相比，F. intestinalis喂养的小鼠中疣微菌纲、变形杆菌纲和丙型变形菌纲类的丰度显著降低（图4B）。相应的，疣微菌科和普雷沃氏菌科的丰度显著降低（图4C）。真杆菌科、真杆菌属和乳酸杆菌的丰度增加（图4B～4F）。真杆菌科中的细菌被称为产生丁酸盐的细菌。在乳杆菌属中，经F. intestinalis处理后Lactobacillus taiwanensis显著增加（图4D，4G）。qPCR和测序均未在肠道中检测到F. intestinalis，说明ob/ob小鼠肠道菌群定殖较差。因此不同肠道条件下F. intestinalis的定殖能力值得进一步研究。在肠道中富集F. intestinalis可以有效重塑肠道菌群，提高肠道丁酸盐的水平，从而降低代谢性内毒素血症。研究结果证明了F. intestinalis对宿主存在有益的作用，并且它模仿了GMD的治疗效果。

本研究采用MSP法和广谱细菌培养基（YCFA）分离得到了产丁酸盐能力较好的菌株。进一步证明口服活肠杆菌能够减少ob/ob小鼠的肥胖，改善代谢紊乱，并增强肠道SCFAs。虽然在人类肠道菌群中，F. intestinalis的丰度相对较低，但其产生丁酸盐的能力以及与其他产生丁酸盐的肠道菌群合作或激活的潜力，使其成为肠道菌群中的关键菌群。因此，培养未知的肠道细菌并揭示其生理功能对于揭示肠道微生物群与宿主之间的相互作用至关重要。

图4 F. intestinalis对ob/ob小鼠的肠道菌群起改善作用

Conclusion

综上所述，本研究证实了F. intestinalis在控制体质量、降低高血糖和高脂血症方面的作用，并证明了肠共栖F. intestinalis在调节GMD治疗效果中的作用。未来需要进一步的研究来证实F. intestinalis作为一种益生菌菌株在治疗肥胖和代谢综合征的潜力。

The enriched gut commensal Faeciroseburia intestinalis contributes to the anti-metabolic disorders effects of the Ganoderma meroterpene derivative

Shanshan Qiaoa,b,1, Kai Wanga,b,1, Chang Liuc,d,1, Nan Zhoud, Li Baoa,e, Jun Wangf, Shuangjiang Liuc,d,*, Hongwei Liua,b,*

a State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

b University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

c State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Tsingdao 266237, Shandong, China

d State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

e Beijing Shijitan Hospital, Capital Medicinal University, Beijing 100038, China

f CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

*Corresponding author E-mail address:

liusj@im.ac.cn

liuhw@im.ac.cn

Abstract

Previous study demonstrated that Ganoderma meroterpene derivative (GMD) increased the abundance of butyrate-producing bacteria in gut and subsequently delivered anti-metabolic disorder effect of host. To specify the key commensal bacteria associating with the beneficial effects, we tried to isolate and compare the microbiota from the cecal samples of GMD- and vehicle-treated ob/ob mice, and further identified butyrate-producing bacterial strains. It was found that Faeciroseburia intestinalis was enriched and 11 strains affiliated to F. intestinalis were cultivated from the gut of GMD-treated mice. In vitro assay attested butyrate production by representative strain of F. intestinalis. Oral administration with F. intestinalis further demonstrated its benefits on regulating hyperglycemia and hyperlipidemia, on decreasing plasma lipopolysaccharide (LPS) and inflammation, and on improving hepatic injuries. Treatment with F. intestinalis effectively enhanced the level of gut butyrate, which subsequently ameliorated the intestinal barrier function and activated epithelial PPAR-γ signaling pathway to regulate microbiome homeostasis in gut. Our study demonstrated that the causal relationship between the butyrate-producing bacteria and the GMD's therapeutic effects and confirmed the important function of the butyrate-producing F. intestinalis in maintaining host metabolism homeostasis.

Reference:

QIAO S S, WANG K, LIU C, et al. The enriched gut commensal Faeciroseburia intestinalis contributes to the anti-metabolic disorders effects of the Ganoderma meroterpene derivative[J]. Food Science and Human Wellness, 2022, 11(1): 85-96. DOI:10.1016/j.fshw.2021.07.010.

编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅

封面图片来源：图虫创意

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