父源印记的表观修饰完整性增强类精子干细胞的发育潜能

图2. ZFP57和H3K9me3的结合促进AG-haESCs父源印记DMR甲基化的维持

责编 | 迦溆

2008年，Austin Smith团队通过添加Mek1/2抑制剂和Gsk3β抑制剂在体外建立了有利于长期稳定维持胚胎干细胞（ESCs）多能状态的培养基：2i，这极大推动了小鼠胚胎干细胞（mESCs）的研究进程【1】。后续研究发现，mESCs在2i培养环境中分化信号通路被抑制，多能性核心调控网络得到增强，被认为是一种接近于3.5天胚胎内细胞团（inner cell mass, ICM）基态（ground-state）的细胞【2】。然而，2017年两篇报道分别对2i培养环境的细胞进行甲基化测序后发现，细胞整体甲基化丢失，其中也包括印记调控区域，从而严重降低了细胞的发育潜能；进一步，将Mek1/2抑制剂替换为Src抑制剂（alternative 2i, a2i）能够在早期（<15代）相对完整地维持mESCs的DNA甲基化模式，从而提升其发育潜能【3,4】。但是，目前这种培养环境能否在长期培养过程中稳定细胞的表观组学还未可知。

2012年，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心李劲松团队和动物研究所周琪实验室成功在2i培养环境下建立了小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs，又称为类精子干细胞），将类精子干细胞注入到卵母细胞后可以产生正常的半克隆小鼠，因此该技术又被命名为半克隆技术【5,6】。然而，细胞的DNA甲基化修饰会在培养过程中逐渐丢失，其中印记DNA甲基化的丢失严重降低了其发育潜能（只有2%左右的胚胎能发育形成半克隆小鼠）。通过在类精子干细胞中敲除两个父源印记调控区域（H19-DMR和IG-DMR），模拟H19-DMR和IG-DMR甲基化维持的状态，可以将半克隆小鼠的出生效率提高到20%【7】。但是这种遗传改造的方式增加了类精子干细胞在应用中的不确定性，如果能够获得在长期培养过程中印记状态稳定维持的类精子干细胞，将进一步促进半克隆技术的应用。

2021年12月5日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的李劲松团队在Protein & Cell杂志上发表了题为 Epigenetic integrity of paternal imprints enhances the developmental potentialof androgenetic haploid embryonic stem cells 的研究长文，这项工作采用基于a2i条件的两步法培养体系，发现能够长期稳定维持类精子干细胞父源印记的表观完整性，进一步提升了该细胞支持半克隆胚胎发育的潜能（最高可达到30%健康小鼠的出生率）。

研究团队首先对类精子干细胞的培养条件进行筛选，发现a2i/L比2i/L的条件能更好地维持父源DMR上甲基化修饰。然而，a2i/L中长期培养也会导致父源DMR上甲基化逐渐丢失。考虑到培养基中血清可能会影响甲基化的维持，因此他们采用无血清的a2i/L培养基（SF/a2i/L）对类精子干细胞进行培养。但是，发现SF/a2i/L无法支持类精子干细胞的体外建立。最终他们巧妙地尝试两步法（图1），即采用含血清的a2i/L建系和无血清的SF/a2i/L进行后续培养（TSa2i/L），成功建立了在长期培养过程中能够稳定维持类精子干细胞父源印记DMR甲基化状态的培养体系（图1）。

图1. 基于a2i培养环境的两步法建立能稳定维持雄性印记的类精子干细胞

作者进一步对机制进行探究，发现类精子干细胞在TSa2i/L环境下，DNMT1和ZFP57的蛋白表达均明显提高，甲基化的印记DMR上H3K9me3和ZFP57结合增加（图2）。通过敲除验证实验，他们发现DNA甲基转移酶的增加使得全基因组以及印记区域的甲基化明显升高，而印记DMR上ZFP57蛋白的特异性结合，能够进一步促进甲基化维持和H3K9me3修饰建立 (图2)。

进一步，作者将培养不同代数的类精子干细胞分别注入成熟的卵细胞中，发现TSa2i/L培养的AG-haESCs能高效获得半克隆小鼠，小鼠出生率最高能达到30%。有趣的是，培养到晚期的类精子干细胞表现出增强的发育效率，与之对应的是细胞中H19-DMR和IG-DMR的甲基化也略有升高。为了进一步探究其中的机制，他们对TSa2i/L培养的类精子干细胞进行挑克隆检测，发现不同的单细胞克隆在H19-DMR的甲基化水平存在异质性。将这些克隆继续培养，低甲基化和高甲基化修饰程度的克隆均能维持原有的甲基化状态，而那些处于中等甲基化水平的克隆表现出上升趋势。进一步研究发现具有不同H19-DMR甲基化水平的细胞增殖能力不同，H19-DMR低甲基化水平的细胞生长受到抑制，从而使得在长期培养过程中H19-DMR高甲基化的细胞由于生长优势比例增加，整体异质性降低并呈现出H19-DMR甲基化上升的趋势。

胚胎干细胞的基因组印记状态对于其发育潜力起了决定性作用，该研究首次建立了能在体外长期稳定维持雄性印记的单倍体胚胎干细胞，进一步促进了其作为精子替代物支持胚胎发育的潜能，有望拓宽半克隆技术的应用潜能。同时，携带稳定雄性印记状态的类精子干细胞也为印记的发育调控研究提供了简便高效的体系。

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）李劲松研究组张红玲博士、李元元博士、马永健博士为共同第一作者；李劲松研究员为通讯作者。本工作得到了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）动物实验技术平台胚胎操作部和基因组标签计划研发中心的大力支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1007/s13238-021-00890-3

制版人：十一

参考文献

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2. Yagi, M., Yamanaka, S., and Yamada Y.(2017). Epigenetic foundations of pluripotent stem cells that recapitulate in vivo pluripotency. Laboratory Investigation 1133–1141.

3. Choi, J., Huebner, A.J., Clement, K., Walsh, R.M., Savol, A., Lin, K.X., Gu, H.C., Di Stefano, B., Brumbaugh, J., Kim, S.Y., et al. (2017). Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature 548, 219-+.

4. Yagi, M., Kishigami, S., Tanaka, A., Semi, K., Mizutani, E., Wakayama, S., Wakayama, T., Yamamoto, T., and Yamada, Y. (2017). Derivation of ground-state female ES cells maintaining gamete-derived DNA methylation. Nature 548, 224-+.

5. Yang, H., Shi, L.Y., Wang, B.A., Liang, D., Zhong, C.Q., Liu, W., Nie, Y.Z., Liu, J., Zhao, J., Gao, X., et al. (2012). Generation of Genetically Modified Mice by Oocyte Injection of Androgenetic Haploid Embryonic Stem Cells. Cell 149, 605-617.

6. Li, W., Shuai, L., Wan, H., Dong, M., Wang, M., Sang, L., Feng, C., Luo, G.Z., Li, T., Li, X., et al. (2012). Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature 490, 407-411.

7. Zhong, C., Yin, Q., Xie, Z., Bai, M.Z., Dong, R., Tang, W., Xing, Y.H., Zhang, H.L., Yang, S.M., Chen, L.L., et al. (2015). CRISPR-Cas9-Mediated Genetic Screening in Mice with Haploid Embryonic Stem Cells Carrying a Guide RNA Library (vol 17, pg 221, 2015). Cell Stem Cell 17, 247-247.

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