机械感应器：核孔复合体的构象变化

撰文丨十一月

在真核细胞中，核孔复合物（Nuclear pore complexes，NPCs）融合内外核膜并介导核质交换。NPC由超过30种不同核孔蛋白组成，形成一个圆柱形的结构。该结构在时间和空间上是高度动态的，关于NPC的直径变化已见报道，但是其形态变化的生理环境以及分子细节尚不清楚。为了进一步揭开NPCs在不同生理状态下结构细节，欧洲分子生物学实验室Martin Beck研究组与Jan Kosinski研究组合作在Science发文题为Nuclear pores dilate and constrict in cellulo，揭开了核孔在不同机械条件下收缩和扩展的构象变化。

核孔复合体的组成蛋白被称为核孔蛋白（Nucleoporins，Nups）。在许多物种中有自己独特的Nups，但是总体来说核孔复合体的结构和功能是跨物种保守的【1】。核孔复合体由位于核孔边缘的胞质面外一侧的胞质环（Cytoplasmic rings，CR）、位于核质面一侧的核质环（Nuclear rings， NR）以及辐条单元组成，以旋转对称的方式排列（图1）【1】。其中Y复合体又被称为Nup107复合体，是外环（Outer rings）的主要组成组分，而内环主要由支架蛋白Nup35、Nup155、Nup188、Nup192以及Nsp1复合体组成。Nup159复合体又被称为P复合体，与Y复合体相互作用介导mRNA的运输。核孔是一个高度动态的结构，在不同的物种中通过各种方式都可以揭示出其直径的变化【2,3】。同时，有研究表明在NPC的组装过程中也会出现扩张的现象【4】。目前已经知道核孔复合体在一些胞内环境变化过程中会出现构象变化，但是其功能性的成因和结果以及结构方面的分析还尚不清楚。

图1 核孔复合体组成核孔结构【1】

为了揭开这一问题的答案，作者们对容易进行遗传操纵的模式生物进行检测，从而可以使用低温聚焦离子束进行标本的细化、低温电子断层扫描以及亚断层扫描结果进行平均化分析。作者们发现酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞具有高通量产生低温层和获取层图片的能力，但比如嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）就没有办法进行NPCs的平均，因为其中的NPCs构象具有很大的差异。作者们通过制备指数生长的酿酒酵母细胞的低温磨碎薄片，获得了178张断层扫描图像，并从中提取了726个NPCs图像。系统性的适应分析可以发现NPC环状结构包括两个同轴的Y复合体环，并且具有经典的头-尾二聚化结构。因此，该扫描结构可以概括目前已知物种核孔复合体的结构朝向和相互作用。

图2 酵母细胞核孔复合体结构

先前的研究表明从分离的核膜或者去垢剂中获取的NPC直径比从完整细胞中得到的直径小。这提示作者们说NPC的大小可能依赖于完整细胞中的生物化学能量水平。为了检测这一可能性，作者们在能量耗尽（Energy depletion，ED）的情况下对NPC构象进行了探究。当ATP耗尽时，作者们发现酿酒酵母中表现出核运输和mRNA输出的减少。能量耗尽的状态下核孔复合体的尺寸显著变小。为了进一步理解NPC的变化中的分子水平的细节，作者们进行了冷冻电镜观测，发现在胞质环那一侧，Y复合体的曲率发生变化，mRNA输出平台明显向孔内侧发生弯曲，腔环的构象在核孔复合体收缩后更加突出。

能量耗尽伴随着核孔直径变小后会减弱，这可能与NPC收缩后的功能相关。因此，作者们想找到一种不依赖于能量耗尽的核孔收缩的实验条件。所以作者们引入了高渗胁迫，将细胞暴露在高浓度的山梨醇条件下。通过对200个NPCs进行冷冻电镜实验，揭示出NPCs存在很强的收缩构象。那么在高渗胁迫以及能量耗尽条件下，核孔复合体的收缩的功能是什么呢？为了揭开这一问题的答案，作者们引入了荧光漂白恢复实验（Fluorescence recovery after photobleaching，FRAP），通过该实验对核孔复合体的被动运输能力进行检测，作者们发现被动核质运输在能量耗尽和高渗胁迫的情况下发生了显著地降低。

随后作者们想知道核孔复合体的形变是如何发生的，因为核孔复合体中的支架核孔蛋白不具有任何已知的活动能力。因此，作者们推断NPC直径的变化更可能是由于施加在外部的机械力引起的。由此，膜张力（Membrane tension）引起了作者们的兴趣，因为膜张力扩张膜面积可以促使在核膜范围内产生侧向的作用力。为此，作者们提出了一个膜张力牵拉膜孔复合体的模型，并提出了几种关于模型的假设。其一，是破坏NPC支架的结构完整性会造成的NPC的收缩；其次，比较坚硬的NPC组分对核膜的侧向力的响应比相对脆弱的NPC组分的收缩更小；其三，核收缩和形变表明了核膜侧向张力的减小等。为了检测这些预测的正确性，作者们进行了一系列的实验验证。通过敲除支架蛋白Nups Ely5以及Nup37作者们发现的确会造成核孔支架结构的收缩，核收缩会造成核总表面积不变的情况下导致核膜过剩。进一步地，作者们对内外核膜（Inner- and outer nuclear membrane）的距离与NPC的直径之间的关系进行检测。在能量耗尽以及高渗胁迫的情况下，内膜核膜的距离出现了显著的降低。因此，NPC的直径与内外核膜距离存在很强的相关性。最后，作者们进行了NPC收缩可逆性的检测。为此，作者们进行了高渗胁迫恢复实验。通过高渗胁迫随后恢复的278个NPCs的分析，作者们确认的NPCs的直径也是可逆的。这些结果说明核膜张力增加会造成NPC的收缩，而核膜张力的减小则会使得NPC支架蛋白的松弛。

图3 工作模型

总的来说，作者们发现活体细胞中的NPCs存在显著的构象变化，这种构象变化会导致NPC的收缩和放大从而对不同的生理信号比如细胞中的能量状态以及渗透胁迫产生响应。另外，作者们发现核膜张力会调节核孔复合体的直径，在高渗胁迫和能量耗尽的状态中NPC收缩与内外核膜之间的距离存在相关性（图3）。因此，NPCs可以对机械线索做出构象反应，具有“机械感受”的功能。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.abd9776

制版人：十一

参考文献

1 Lin, D. H. & Hoelz, A. The Structure of the Nuclear Pore Complex (An Update). Annual review of biochemistry 88, 725-783, doi:10.1146/annurev-biochem-062917-011901 (2019).

2 Mahamid, J. et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science (New York, N.Y.) 351, 969-972, doi:10.1126/science.aad8857 (2016).

3 Allegretti, M. et al. In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature 586, 796-800, doi:10.1038/s41586-020-2670-5 (2020).

4 Otsuka, S. et al. Postmitotic nuclear pore assembly proceeds by radial dilation of small membrane openings. Nature structural & molecular biology 25, 21-28, doi:10.1038/s41594-017-0001-9 (2018).

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