灵长类动物性别分化过程中X染色体剂量平衡机制

撰文丨十一月

哺乳动物具有两种性染色体，分别是X染色体和Y染色体。雌性具有两个X染色体而雄性具有一个X染色体和一个Y染色体。X染色体上具有超过800个基因，相比之下Y染色体上主要包含雄性性别决定因子SRY，但Y染色体上的基因不多【1，2】。为了确保X染色体与常染色体以及性别决定之间的基因剂量平衡，生物体进化出一套机制：X染色体上调（X chromosome up-regulation，XCU）以及X染色体失活（X chromosome inactivation，XCI）【3】。XCI过程在小鼠中已经进行了深入的研究，为染色体活性的表观遗传调控提供了重要的研究范例。长非编码RNA Xist在激活X染色体抑制的事件中发挥核心作用，促进X染色体上表观遗传景观的变化，比如H3K27me3修饰以及H2AK119u1，从而导致发育早期阶段的XCI。然而，最近的研究表明哺乳动物中的XCI机制存在关键性差异，人类中XIST的出现不足以导致XCI。因此，XCI的具体机制还有尚待解决的问题。为了揭开高等哺乳动物中XCI的作用机制，日本京都大学Mitinori Saitou研究组在Science发文题为The X chromosome dosage compensation program during the development of cynomolgus monkeys，发现了食蟹猴发育过程中X染色体剂量补偿程序。

图1 食蟹猴

食蟹猴 (Macaca fasicularis) 是与人类关系密切的灵长类动物，它们可以作为人类发育过程的参考模式，用于对X染色体失活剂量补偿机制的研究。为此，作者们首先对食蟹猴早期发育和生殖细胞发育过程中的X染色体失活进行了全面的表征。首先，作者们通过对胚胎进行RNA-FISH检测了食蟹猴中XIST以及X染色体连锁基因的表达。在8细胞期也就是胚胎期E3，雄性和雌性胚胎中同时能检测XIST以及X染色体连锁基因。在雌性胚胎中E7存在两个弥散的XIST区域，与X染色体连锁基因的信号毗邻。此时X染色体的状态是XaXIST+/XaXIST+，两个X染色体均是激活表达的，且其上包含XIST的信号。在E8时期，70%的胚胎中的包含两个XaXIST+，20%的胚胎只具有一个，此时X染色体的状态是XiXIST+/XaXIST-（图2）。在E9时期，XiXIST+/XaXIST-微微上升。在雄性胚胎中，E7时期滋养外胚层细胞中60%具有XaXIST+，而到E8时期80%的滋养外胚层细胞中X染色体表现为XaXIST-，而内细胞团中则表现出80%X染色体是XaXIST+状态。因此，该结果说明食蟹猴胚胎中父本和母本来源的X染色体上均存在XIST的覆盖，但是染色体水平的XCI并不是从囊胚期开始的。

图2 胚胎着床前雌性胚胎中X染色体的特征

进一步地，作者们对X染色体上抑制性的表观遗传标记进行了检测。在E7时期，雌性大多数NANOG-的滋养外胚层细胞和NANOG+的内细胞团细胞均表现出两个H3K27me3富集的区域，且该区域与DAPI凝缩的区域一致。但是到了E8阶段，滋养外胚层细胞中会丢失一个H3K27me3富集的区域，而内细胞团中仍然是两个。雄性中，70%的滋养外胚层细胞中具有一个H3K27me3富集的区域，而到E8会丢失该区域，而内细胞团中在E7和E8阶段则始终会保持一个H3K27me3富集的区域。H2AK119u1染色也具有相似的结果。因此，X染色体上表达XIST招募H3K27me3以及H2AK119u1信号，但是这些修饰并不足以建立XCI。通过3D-SIM成像，作者们发现XaXIST+对染色体会经历一个凝缩状态，但仍然是活跃的X染色体，这可能是XCI建立的前奏。

为了对促进XCI发生和建立的时间点进行确认，作者们分析了食蟹猴着床后的胚胎，发现所有的细胞均是XiXIST+/XaXIST–状态，并且XiXIST+所在的区域DAPI是凝缩的。该结果说明在胚胎着床时XCI被快速地建立起来。归纳起来，在大多数的细胞中X染色体的状态从XaXIST+/XaXIST+到XaXIST–/XaXIST+，XIST表达开始下调，随后变为XaXIST–/XiXIST+，此时X染色体连锁的基因表达降低。为了变成未来的Xa，XaXIST+上会富集H3K27me3以及H2AK119u1的信号抑制XIST的表达，然后擦除H3K27me3/H2AK119u1信号，而另外一个X染色体则持续表达XIST并同时富集H3K27me3/H2AK119u1信号，最终建立成为XCI。

随后作者们是使用单细胞mRNA 3’末端测序（SC3-seq）【4】的方式对XIST以及X连锁基因地特异性表达进行检测。作者们发现在雌性中的X染色体与常染色体的比例是恒定的，但是在E16时期会开始下降然后再次回到初始水平。

在原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs）中会经历X染色体重新激活（X chromosome reactivation，XCR）的现象。XCR的具体机制和方式还不甚清楚，尤其是在灵长类动物中。有研究表明，人类中XCR开始于发育阶段的第四周，XIST会开始激活【5，6】。所以为了揭开这一问题的答案，作者们对食蟹猴中原始生殖细胞中的X染色体活性的动态变化进行了检测。在食蟹猴的原始生殖细胞中，一大部分细胞抑制XIST的表达，X染色体连锁的基因逐渐升高。因此，原始生殖细胞从特化过程起始XCR过程，XCI/XCR的分布状态可以表征特化过程。在E32时期，70%的原始生殖细胞或者卵原细胞会丢失H3K27me3富集的区域，而在E48时期，所有的卵原细胞中都将不存在H3K27me3富集的信号。在生殖细胞中X染色体和常染色体的比例会随着发育过程逐渐增加，而在卵原细胞中X染色体与常染色体的比例约为1。因此，在生殖细胞中E13-E17阶段X染色体上会抑制XIST表达，然后E22-E28天擦除H3K27me3的标记，随后E42时期再次表达XIST。X染色体连锁的基因会在早期E13阶段表现出双等位基因表达，不经过表达抑制过程或者只是经过再次激活，达到完全的双等位基因表达。

图3 工作模型-食蟹猴X染色体失活具体时间框与XIST变化过程

总的来说，该工作发现与人类进化上更为接近的食蟹猴中X染色体剂量平衡的机制：父本和母本的X染色体均会表达XIST，并招募表观遗传标记H3K27me3和H2AK119u1信号。X染色体出现持续性的凝缩，但此时仍然是活跃的X染色体；未来活跃的Xa染色体会抑制XIST的表达，并在XCU过程中擦除抑制性的表观遗传标记，而未来失活的Xi染色体则会维持XIST的表达以及抑制性的表观遗传标记，在XCI过程中促使染色体凝缩（图3）。

该工作揭开了灵长类动物与小鼠等哺乳动物X染色体失活过程中的不同，同期刊发了观点文章对该工作进行介绍，题为Digging into X chromosome inactivation，为进化上X染色体失活机制的分歧出现提供了新的见解。XCI动力学变化、具体分子机制在小鼠的研究较多，XCI发生在胚胎植入前的早期4-8细胞阶段，由长链非编码RNA Xist触发，顺式作用覆盖整个X染色体，从而导致基因沉默，确保X染色体表达的平衡。但人类中XIST出现时期较晚，不足以导致XCI的发生。通过在食蟹猴中的研究发现XIST RNA也会积累在活跃的X染色体中，但此时与XCI过程并不相耦连，XIST的积累伴随一些抑制性的表观遗传修饰，虽然不足以导致X染色体连锁基因表达的沉默，但是会促进XIST的扩展以及将X染色体锁定在失活状态。人类中的X染色体失活机制仍需进一步地检测，人类中存在一种独特的、其他灵长类动物中不含有的XACT RNA，所以人类中的XaXIST+染色体不会积累抑制性的表观遗传修饰。该工作由于对食蟹猴X染色体剂量补偿机制，为进一步揭开人类中的X染色体失活提供了相关的证据。

图4 人类、灵长类以及小鼠X染色体失活机制的不同

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.abd8887

制版人：十一

参考文献

1 Skaletsky, H. et al. The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature 423, 825-837, doi:10.1038/nature01722 (2003).

2 Ross, M. T. et al. The DNA sequence of the human X chromosome. Nature 434, 325-337, doi:10.1038/nature03440 (2005).

3 Deng, X., Berletch, J. B., Nguyen, D. K. & Disteche, C. M. X chromosome regulation: diverse patterns in development, tissues and disease. Nature reviews. Genetics 15, 367-378, doi:10.1038/nrg3687 (2014).

4 Nakamura, T. et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature 537, 57-62, doi:10.1038/nature19096 (2016).

5 Chitiashvili, T. et al. Female human primordial germ cells display X-chromosome dosage compensation despite the absence of X-inactivation. Nature cell biology 22, 1436-1446, doi:10.1038/s41556-020-00607-4 (2020).

6 Guo, F. et al. The Transcriptome and DNA Methylome Landscapes of Human Primordial Germ Cells. Cell 161, 1437-1452, doi:10.1016/j.cell.2015.05.015 (2015).

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