线粒体基因体外沉默系统

撰文 | 十一月

线粒体具有自己的基因组，因此是“麻雀虽小，五脏俱全”的细胞器。人类线粒体基因组编码了氧化磷酸化系统（Oxidative phosphorylation system，OXPHOS）中的13个组分，线粒体基因组表达的缺陷会造成严重的神经肌肉疾病。但是由于缺乏能够对线粒体基因组表达进行操纵的手段，线粒体中的基因组表达的具体分子机制还不甚清楚。

为了对该空白进行弥补，德国哥廷根大学医学中心Peter Rehling研究组发文问题为An in vitro system to silence mitochondrial gene expression，建立了一个体外的系统可以对线粒体基因表达进行沉默。

线粒体通过运输一些核编码的蛋白以及表达线粒体基因组对其蛋白质组进行塑造。线粒体基因组表达需要通过线粒体RNA聚合酶POLRMT对线粒体基因组进行转录【1】。线粒体中的转录本逐渐成熟，这些成熟步骤会发生在线粒体RNA颗粒（Mitochondrial RNA granules）【2】中，这些颗粒中也会进行核糖体成熟以及RNA周转等步骤。因为OXPHOS对细胞功能至关重要，因此线粒体基因表达的每一步的缺陷都与人类疾病息息相关【3】。虽然已经对线粒体基因表达的一些关键因素比如POLRMT聚合酶有一定了解，但是我们对于基因表达如何整合到细胞和线粒体环境的仍然缺乏认知。因为目前还缺乏针对线粒体基因的操作技术，这是目前该领域发展的一个主要障碍。如何靶向线粒体RNA从而干扰基因表达过程是一个可供参考的新策略。

为此，作者们构建了一个体外系统可以靶向线粒体mRNA翻译的系统。该系统利用化学合成的蛋白质-吗啉嵌合体（Protein-morpholino chimera）导入到体外纯化出的线粒体中，从而能够特异地阻止mRNA的翻译。为此作者们表达并纯化的线粒体蛋白Jac1，之所以选择Jac1是因为体积小、折叠简单、可溶性好，并且其中只包含一个半胱氨酸。作者们发现荧光标记的Jac1能够有效地运输进入体外纯化的线粒体之中，并且在膜电位存在的情况下表现出对蛋白酶K的抵抗性。但是Jac1本身会在进入线粒体后进行加工，这一加工过程并没有有效地进行，所以作者们增加了一个DBCO（Dibenzocyclooctyne group）的修饰，进一步地作者们再将单链DNA、RNA寡核苷酸以及MO（Morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides）共价连接上去。作者们设计的MO是针对的COX1 mRNA的5’末端。COX1是线粒体编码细胞色素c氧化酶I。随后作者们检测的Jac1-COX1运输进入线粒体对COX1的翻译的影响，作者们发现在加入MO嵌合体后，COX1的翻译被显著降低。

进一步地，作者们对该系统的使用参数进行检测，从而使该系统能够在应用方面更加成熟。作者们发现在2μM的使用浓度下，Jac1-COX1-MO系统能够达到最显著地对于COX1的翻译的抑制，但是在较低的浓度0.5-1μM仍然能够有效地进行COX1的翻译抑制。另外，作者们发现该嵌合体系是通过TIM23信号通路移动进入线粒体之中。因此，Jac1-COX1-MO嵌合系统可以有效地靶向COX1 mRNA并且以很高的浓度选择性抑制COX1的翻译。通过该系统，作者们对COX1的生物合成步骤进行了解析。因此该结果证明体外嵌合体系将是很好的探究线粒体基因表达的工具。

随后，作者们希望将该系统的应用进一步扩展，所以对氧化磷酸化的四个复合体中（图2）线粒体编码的各个组分分别进行嵌合体系基因沉默操作。通过设计不同的MO，作者们发现该嵌合系统内能够特异性的、高效率的降低目标基因的翻译。利用该系统，作者们对氧化磷酸化复合体V中的组分ATP6以及ATP8进行敲降，从而可以对这两种组分的生物合成进行探究。作者们发现ATP6的合成依赖于ATP8的翻译，并且会通过单一的核糖肽转录本联合出现。另外，通过对线粒体编码表达的基因进行遗传操作，作者们对线粒体RNA的相互作用进行了定义，丰富了大家对于线粒体中相互作用关系的认识。

图2氧化磷酸化四个复合体中由线粒体编码的组分

总的来说，该工作建立了一种能够特异性敲降线粒体编码表达的基因的方法，通过将前体与吗啉构建嵌合系统，能够高效地降低目的蛋白的翻译。但是该系统也存在一定的缺陷，比如该系统的验证主要是在体外纯化的线粒体中进行的，更为体内的实验尚待验证。而且由于该系统的工作需要借助于线粒体能够高效输入该嵌合体，因此线粒体的状态与适应度对基因沉默的效果也有着一定的影响。不过，“万事开头难”，尽管有这些担忧，但该技术依然是能够以高时间分辨率的转录特异性方式解决有关线粒体基因表达的重要工具。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.033

参考文献

1 Antonicka, H. & Shoubridge, E. A. Mitochondrial RNA Granules Are Centers for Posttranscriptional RNA Processing and Ribosome Biogenesis. Cell reports 10, 920-932, doi:10.1016/j.celrep.2015.01.030 (2015).

2 Pearce, S. F. et al. Regulation of Mammalian Mitochondrial Gene Expression: Recent Advances. Trends in biochemical sciences 42, 625-639, doi:10.1016/j.tibs.2017.02.003 (2017).

3 Brischigliaro, M. & Zeviani, M. Cytochrome c oxidase deficiency. Biochimica et biophysica acta. Bioenergetics 1862, 148335, doi:10.1016/j.bbabio.2020.148335 (2021).

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