清华大学团队研发治疗性工程益生菌，或将显著提高结肠炎治疗效果

近年来，通过益生菌重建传递药物分子或介导诊断方法的工程活疗法逐渐成为生物医学工程和合成生物学领域的研究热点。

“合成生物学技术可以赋予微生物崭新的特质，即可结合实际医疗需求，‘个性化定制’改造后的微生物药物，” 清华大学生命科学学院陈国强课题组博士生闫煦表示，“通常情况下，这种微生物药物的竞争性更强，更具有靶向性、缓释性和可控性。”

图丨闫煦（来源：受访者）

与野生型底盘菌相比，微生物工程菌的确具有多种优势，包括位点特异性给药、可持续释放和机制可控治疗等，并且已经有大量研究报告充分展示了转基因活细菌在治疗苯丙酮尿症、高氨血症、糖尿病、肥胖、酒精性脂肪肝和癌症等方面的广阔前景。

一直致力于合成生物学、微生物代谢工程研究的陈国强团队此次将目光转向了结肠炎，这种由细菌、真菌、病毒、寄生虫、原虫等生物引起的疾病，不但病程冗长，容易反复发作，还伴有并发结肠癌的危险。

图 | EcNL4 治疗方案示意图（来源：Cellular & Molecular Immunology）

通过口服肠道益生菌药物抑制炎症是一种常见的治疗策略，大肠杆菌 E. coli Nissle 1917（EcN）就是其中的一种。为了提高 EcN 的治疗功效，陈国强团队通过在 EcN 中过表达 3HB 的方式，获得了一株重组菌 EcNL4，其可以在肠道定植，以食物为原料合成药物，药物直接在原位缓释，降低了药物的脱靶作用，使药物递送更加有效，其药效远比 EcN 和 3HB 单独作用时更强，在治疗肠炎时展现了 “1+1＞2” 的效果。

该研究成果于 2021 年 9 月 3 日发表在国内第一本免疫学英文杂志《自然细胞与分子免疫学》（Cellular & Molecular Immunology），标题为 “Construction of a sustainable
3-hydroxybutyrate-producing probiotic Escherichia coli for treatment of colitis”。论文的通讯作者为陈国强，第一作者为其博士生闫煦。此项研究作既开发出了更加有效的益生菌，也为工程益生菌治疗疾病提供了概念证明。

图丨相关论文（来源：Cellular & Molecular Immunology）

重组菌 EcNL4 的功效为什么能做到 “1+1＞2”？

羟基丁酸（3HB）是人类酮体的组成部分之一，常常作为饥饿或运动时的能量来源。除此之外，3HB 也被认为是一种治疗剂，实验证明口服 3HB 药物对癫痫、高血压、NLRP3 介导的炎症或神经退行性疾病等多种疾病均有治疗作用。在小鼠中施用 3HB 后，还观察到骨形成促进、学习和记忆的改善以及神经胶质细胞保护。

图 | E.coli Nissle 1917 用于 3HB 过量生产的代谢工程（来源：Cellular & Molecular Immunology）

最近，在动物模型中，3HB 已被证明可以改善葡聚糖硫酸钠 (dextran sulfate sodium，DSS) 诱导的结肠炎。而 EcN 通常用于治疗炎症性肠病 ( inflammatory bowel disease，IBD)，因此将治疗性化合物和益生菌联合使用可能会显示出协同作用，治疗物质的原位合成还可以减少药物的脱靶效应，并在更长的时间内有效地输送物质，从而显著提高结肠炎的治疗效果。

简单来说，该团队成功构建了一种工程化的活体治疗药物 EcNL4，其可持续释放 3HB 来靶向胃肠道，从而改善肠道微生物群，改善小鼠结肠炎。

也就是说，与现有微生物药物相比，合成生物学设计的微生物药物可通过选择高定植性的底盘菌株，提高自身鲁棒性，过表达表面黏附物质，参与肠道关键生命活动等方式成为优势菌群。

闫煦还指出，这种药用益生菌的功效是养乐多等益生菌饮料所难以比拟的，因为后者虽然拥有上亿个活菌（乳酸菌、双歧杆菌类），但喝下去之后能够到达肠道并且定植的活菌微乎其微。而且，这些饮料为了获得更佳的口感，会将糖含量提升到非常高的水平，但过高的糖含量对人体是有害的。所以这些产品需要克服的一点就是如何把糖含量降下来的同时还能保证口感。

如何选择底盘细胞？

“在整个研究过程中，底盘细胞的选择第一步，同时也最有难度、最有技巧的一步。如果第一步选择失误，后面做起来会很艰难。” 闫煦表示。

他坦言，乳杆菌、乳球菌和大肠杆菌等人类共生细菌都比较适合作为医学工程的底盘，但课题组起初并没有直接确定使用 EcN 这种菌。为了使新菌类能在肠道中达到更好的定植效果，他们是对肠道里大量存在的革兰氏阳性菌、乳酸菌、芽孢杆菌等进行了大量的实验，分别使用这些菌来生产羟基丁酸，最终发现这些菌均存在产量较低的问题。

而大肠杆菌 E. coli Nissle 1917 (EcN) 的优势则十分突出，包括突出的益生菌特性，以及易于进行基因操作。具体而言，该菌株为非致病性 (血清型 O6:K5:H1)，对志贺氏菌、霍乱弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、肠炎沙门氏菌、侵袭性大肠杆菌等肠道病原体具有拮抗活性，并且有足够的分子生物学工具箱用于 EcN 工程。并且这种细菌还具有遗传稳定性，不会被肠出血性大肠杆菌菌株的毒噬细胞转化，还能够产生防御素、导管素和钙卫蛋白，具有抗炎作用，例如抑制参与多种生理与免疫过程的重要细胞因子白细胞介素 - 6 (IL-6) 和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)。活 EcN 细菌在哺乳动物胃肠道中表现出稳健性。因此，基于 EcN 载体的多种生物治疗策略是可行的。

图丨基因组工程提高 3HB 产量（来源：Cellular & Molecular Immunology）

之后，他们进一步选择了两种细菌宿主野生型 EcN 或 EcNΔldhA，用于基因组工程。EcNL2 在 EcNΔldhA 菌株的基因组中过度表达 phaBCn，产生了 0.4 g/L 3HB，与其他基因组插入候选物相比达到了最高的 3HB 浓度；然后测试了多种启动子以增加 3HB 滴度，启动子 pfnrS、J23119 和 J23110 分别在 EcNL4、EcNL5 和 EcNL6 菌株的功能基因上游克隆，以 EcNL3 为对照，不在基因前插入启动子。研究发现，菌株 EcNL4 表现出更好的性能，其在微需氧条件下产生的 3HB 超过 0.5 g/L，达到候选菌株中的最高值。

闫煦总结道：“所以，在进行底盘菌的选择时，建议从以下几方面进行思考：1、结合自己实际的研究情况以及想要达到的研究效果；2、可参考其他实验使用的是哪些底盘菌；3、通过设定某一些具体的实验状态，来筛选出来高产菌株；4、不同的底盘菌往往匹配使用不同的合成生物学操作手段，可以尽量选择一些操作更简单，且发展较为成熟的合成生物学技术，这将有助于大大简化在分子操作层面耗费的时间。”

永久定植的难点与商业化进程

“永久定植” 与 “即时响应”，一直是合成生物学领域内的两大热门话题。永久定植需要益生菌在多变的肠道环境中扮演不可或缺的位置；即时响应需要益生菌实时感受肠道炎症状态，随后将信号呈递给药物生产模块。那么，能否通过设定细胞程序，使其单次给药就可以实现永久定植，并在炎症发生时，即时响应进行治疗？

闫煦介绍道，目前来说，难点在永久定植方面。因为人类肠道是一个十分复杂的系统，里面的菌群只是处于一个相对稳定的状态，例如，几种主要菌类占比较多，但具体到个体层面上，实际的波动性较大。

换句话说，有的菌类在其中占据一定的优势，但是随着人的食谱发生改变，吃进去的东西不同，自然也就会筛出来不同的肠道菌；肠道菌群还会随着年纪增长发生变化；另外，人在生病时服用的抗生素进入肠道后会对肠道菌进行重新洗牌。正因为肠道菌之间的竞争实在太激烈了，所以永久定植的难度非常大。

“因此，相对于永久定植，我们更加期待在较长的一段时间内实现可控的定植，能够更好的提高工程菌的使用灵活度和使用效果。” 闫煦表示。

图 | EcNL4 对小鼠结肠炎的改善效果优于野生型 EcN（来源：Cellular & Molecular Immunology）

该篇论文中提到，EcN 被发现与泌尿致病性大肠杆菌（UPEC）菌株 CFT073 密切相关，但被证明具有上皮屏障保护能力。然而，一些研究表明，小鼠对肠出血性大肠杆菌 O157:H7 菌株并不十分敏感。因此，在这项研究成果真正实现商业化落地之前，陈国强团队还将在大鼠、兔子或干细胞衍生的人类肠道类器官上进行后续研究，以进一步支持小鼠的阳性治疗结果，然后开展灵长类动物实验，最后才能进入到人体临床试验层面，评估临床应用效果。

该研究团队表示还需要先走完以下这几步：包括在老鼠、兔子等动物模型上进行实验，最后才能进入人体实验层面。

闫煦进一步补充道，“现阶段，我们主要面临三方面的问题：不确定这种工程化菌移到了其他动物模型上之后，能否获得和小鼠模型一样的理想效果；当把这种菌喂给其他动物时，我们需要精确设计不同的给药数量以及给药方式；最后，我们研发的重组菌 EcNL4 经过了基因改造，那么这种大众印象中的转基因事物的稳定性、安全性如何，对人有没有危害，这些都是需要进一步仔细探讨的问题。”

尽管存在上述一系列不确定性，但不可否认的是，合成生物学技术设计的活体药物的 “可定制性” 特点，与精准医疗的大方向不谋而合，未来无疑将展现出更大的潜力。

目前，合成生物学微生物药物的相关研究已经取得了诸多进展，例如，工程菌已经应用在苯丙酮尿症、高血氨症、糖尿病、肠炎、肥胖、脂肪肝以及某些实体瘤的治疗上；相当一部分已经进入临床一期，治疗苯丙酮尿症和高血氨症的微生物药物已进入临床二期。

写在最后

值得一提的是，陈国强还是合成生物学初创公司微构工场的创始人兼首席科学家，（点击直达：国内合成生物学领域「泰斗级」学者创办公司，天使轮获近 5000 万融资，红杉种子领投！打造「下一代工业生物技术」生产新材料的平台）微构工场利用嗜盐菌，以多种碳源为原料生产包括聚 -3 - 羟基丁酸（PHB）在内的各类 PHA。

PHB 可作为药物载体使用，也可作为生产高纯度 3HB 的原料。陈国强团队还成功研制出以盐单胞菌作为底盘菌高效生产 PHBHHx 的工艺，PHBHHx 不仅具有良好的材料性质，生物相容性也非常优秀。该材料已被开发为体内可降解支架、药物缓释的纳米材料以及手术缝线等。

PHBHHx 在其他生物医疗方面的应用也在研究中，拥有广阔的应用前景。