《食品科学》：产Reuterin罗伊氏乳杆菌的定向筛选及其生物学特性

随着抗生素的滥用，超级细菌及环境污染问题日益严重，迫切需要开发有效、绿色无污染的抗生素替代品。罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）作为一种广泛存在于脊椎动物肠道的共生微生物，是肠道微生态系统中的优势菌群，长期作为益生菌使用，在预防腹泻、改善胆固醇代谢、缓解抑郁症及降低婴幼儿哭闹等方面具有重要功能。Reuterin是罗伊氏乳杆菌代谢甘油产生的一种特有广谱抗菌物质，它是一种复杂混合物，主成分为3-羟基丙醛，对多种病原微生物均有较强的抑制作用，在生物防腐方面极具潜力。

目前，国内外多数研究报道从鸡、猪、鼠、婴儿和成人的粪便中分离到罗伊氏乳杆菌，而从健康家禽粪便中筛选产Reuterin的罗伊氏乳杆菌的报道相对较少。为此，南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室的李一娟、邵开生、张志鸿*等人利用选择培性养基从健康家禽粪便中定向筛选产Reuterin的罗伊氏乳杆菌，并评价其生物学活性，以期为益生菌的开发和利用提供候选菌株。

1、分离株的鉴定及其产Reuterin能力

结果如图1所示，4 株菌均与已知菌株的序列同源性在99%以上，均可确定为目标罗伊氏乳杆菌，命名为WLRE01、WLRE02、WLRE03、WLRE04（分别来自于鸭、鸭、鸽、鸽的粪便）。针对编码Reuterin的pduC基因构建特异性PCR，验证4 株罗伊氏乳杆菌是否携带pduC基因，结果如图2所示，WLRE01、WLRE03和WLRE04均携带pduC基因，而WLRE02（泳道4）和阴性对照（泳道C）均无特异性条带，说明不携带pduC基因。对筛选到的4 株罗伊氏乳杆菌进行甘油发酵，只有3 株携带pduC基因的菌株发酵甘油后产Reuterin，且WLRE04产量最高，达（9.722±0.168）mg/mL（表2）。

2、耐酸耐胆盐能力

由图3A可知，在pH 2.5条件下处理3 h后，3 株菌均维持在10 6 ～10 7 CFU/mL，而WLRE04活菌数与对照组相比显著降低（P＜0.05）；处理6 h后，3 株菌活菌数相比对照组均显著降低（P＜0.05），其中WLRE04活菌数下降最明显，达1 个数量级（P＜0.000 1），这与贾丹等报道的罗伊氏乳杆菌ZL2a的结果一致。在pH 3.5条件下（图3B）处理3 h或6 h后，3 株菌活菌数变化较少，均维持在10 6 ～10 7 CFU/mL，只有WLRE01在6 h后的活菌数相比对照组显著下降（P＜0.05）。由图3C可知，在胆盐质量浓度为1.5 g/L的环境条件下，3 株菌活菌数随孵育时间延长呈逐渐下降的趋势，处理3 h后，WLRE03活菌数基本维持初始水平，WLRE01、WLRE04活菌数均显著下降（P＜0.000 1）；处理6 h后，WLRE01、WLRE04活菌数继续下降至10 6 CFU/mL。

3、耐过氧化氢能力

从图4A可以看出，3 株菌在含0.6 mmol/L过氧化氢的MRS培养基中状态良好，甚至有活菌数升高的趋势，尤其是WLRE03、WLRE04在处理6 h后活菌数与对照组相比显著升高（P＜0.000 1）；当过氧化氢浓度为1 mmol/L时，处理3 h后，只有WLRE01活菌数显著下降（P＜0.000 1）；而处理6 h后，3 株菌活菌数相比对照组均显著下降（P＜0.000 1），其中WLRE01活菌数下降约2 个数量级，而WLRE03、WLRE04活菌数下降不足1 个数量级（图4B）。由此说明，3 株菌均有比较好的抗氧化能力，而WLRE03和WLRE04表现最佳。

4、模拟胃肠液耐受力

图5结果表明，WLRE03模拟十二指肠液消化后，与对照组相比活菌数有明显下降（P＜0.01），在模拟肠液中消化2 h后，活菌数虽有明显下降，但仍保持了较高的水平（2.11×10 8 CFU/mL）；WLRE01、WLRE04经过模拟胃液和十二指肠液消化后，活菌数基本保持不变，经过模拟肠液消化2 h后，与对照组相比，活菌数均显著下降（P＜0.001，P＜0.000 1），但不足1 个数量级，这与张如春等报道罗伊氏乳杆菌JF036的结果一致，其经模拟胃肠液处理后，活菌数仍高于1.0×10 8 CFU/mL。该结果说明，本研究3 株菌对模拟胃肠液均具有良好的耐受性。相比于单纯的酸环境，菌株在模拟胃液中的活菌数水平更高，这可能与胃蛋白酶削弱了酸对菌体的胁迫有关。模拟肠液对3 株菌的活力均产生负面影响，这可能是受到胆盐作用的影响。

5、抗生素敏感性

由表3可知，筛选的罗伊氏乳杆菌对不同种类的抗生素表现出不同的敏感程度。它们对庆大霉素、氯霉素和利福平均比较敏感，对环丙沙星、红霉素、四环素和卡那霉素具有抗性。

6、甘油发酵上清液的抑菌能力评估

如表4所示，甘油发酵液上清液对金黄色葡萄球菌表现出较高的抑制能力，这与池海波等的研究结果一致。与非甘油发酵相比，WLRE01、WLRE03和WLRE04的抑菌圈直径分别增大了14、20、17 mm，说明金黄色葡萄球菌对Reuterin非常敏感；单核细胞性李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌也表现出较强的Reuterin敏感性；特别的是，甘油发酵上清液对大肠杆菌无明显的抑菌能力，推测该菌可能含有相关抗性基因。

7、黏附肠上皮细胞的能力

肠上皮细胞黏附能力是评价乳酸菌益生功能的一项重要指标，也是其定植于肠道发挥益生功能的前提条件。本研究定向筛选的罗伊氏乳杆菌均具有良好的肠上皮细胞黏附能力，黏附率在72%以上（图6）。其中WLRE01黏附率高达81%，这与张紫薇等研究报道的罗伊氏乳杆菌J1的黏附性能相似，其黏附率为87.93%。由于其来源于家禽肠道，其是否能在其他宿主肠道黏附定植并长期发挥其益生功能有待进一步探究。

结 论

本研究采用选择性培养基从健康家禽新鲜粪便定向筛选到4 株罗伊氏乳杆菌，经生理生化及分子生物学技术证明其是需要的目标菌株，命名为WLRE01、WLRE02、WLRE03、WLRE04。通过菌株发酵代谢实验说明其中WLRE01、WLRE03、WLRE04能产抗菌物质Reuterin，且WLRE04的产量高达（9.722±0.168）mg/mL，其甘油发酵上清液对一些食源致病菌具有很强的抑制能力，而对金黄色葡萄球菌的抑制圈直径达（28.1±1.2）mm；它们能在pH 2.5、pH 3.5和1.5 g/L胆盐条件下维持较高活菌数达6 h，且能受模拟胃肠液消化而保持稳定的细胞浓度；同时，它们还表现出良好的抗氧化活性以及肠上皮细胞黏附能力。由此，可推测这些菌株均可以顺利通过胃肠道的极端环境条件，并黏附定植于胃肠道。它们可作为肠道益生菌候选菌株，供进一步研究。

本文《产Reuterin罗伊氏乳杆菌的定向筛选及其生物学特性》来源于《食品科学》2021年42卷14期32-38页，作者：李一娟，邵开生，张娜，孟迎平，陶雪莹，周颖钰，魏华，张志鸿。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20201101-003。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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