翻译结束后怎么停？新技术揭示翻译终止全过程

撰文 | 十一月

责编 | 酶美

翻译终止（Translation termination）是指将一个新生多肽链从核糖体中释放出来，该事件必须准确而迅速地进行。核糖体在遇到开放阅读框的终止密码子时候，蛋白质的合成结束。翻译终止主要触发两个因素，从而促进新生多肽的释放【1】。这两个因素分别是真核释放因子eRF1（eukaryotic release factor 1），是一种tRNA形状的蛋白质，能解码核糖体氨酰-tRNA位点也就是A位点的终止密码子，并切割肽基-tRNA键，另外一个是真核释放因子eRF3，是促进eRF1发挥作用的GTPase。蛋白质合成主要包括三个步骤，肽链翻译的起始、延伸以及终止过程。这就不得不提到蛋白质翻译过程中核糖体的几个活性结合位点（图1）。A位点是氨酰基位点，是氨酰-tRNA结合的位点；P位点是与延伸过程中的肽酰-tRNA结合的位点；而E位点是退出位点，脱酰胺的tRNA完全释放的一个位点。起始过程包括核糖体大亚基与氨酰-tRNA与结合在mRNA上的小亚基结合，核糖体沿着mRNA移动并通过转肽反应使多肽链延长，最终多肽链从mRNA上释放，核糖体大小亚基解聚。对于翻译终止以及其对正常翻译关键步骤的理解，对于密码子提前终止所导致的疾病比如囊性纤维化、肌肉营养不良等可能会提供重要的参考思路。

图1 核糖体活性结合位点与mRNA翻译过程

尽管关于翻译终止已有数十年的研究，但是由于传统方法的局限驱动翻译终止的分子事件的顺序和时间仍然不清楚。为了探究翻译终止过程的调控机制，美国斯坦福大学Joseph D. Puglisi研究组以及约翰霍普金斯大学Rachel Green研究组合作在Science发文题为Mechanisms that ensure speed and fidelity in eukaryotic translation termination，揭开了真核生物中翻译终止中确保速度和保真度的具体分子机制。

为了揭开驱动翻译终止的分子时间的顺序和时间，作者们使用了体外重组酵母翻译系统【2】以及单分子荧光光谱学的方式对真核释放因子的动态变化以及终止过程进行追踪。为了进一步缩短核糖体翻译的时间，作者们构建了非常短的开放阅读框mRNA，使得该系统更为简单。核糖体复合物结合在M-Stop或者是M-F-Stop的mRNAs上，然后与纯化的Met-tRNAMeti、起始因子、延伸因子和tRNAs进行孵育，并与饱和量的eRF1和eRF3反应（图2）。这样可以通过荧光共振能量转移技术的信号来确定eRF1和eRF3在翻译终止中的作用。

图2 eRF1与核糖体可以通过荧光共振能量转移技术检测相互作用

在该体系中作者们发现释放因子释放后，检测到与核糖体A位点的快速、浓度依赖的eRF1结合。而在没有eRF3的情况下，eRF1与这些复合物的结合非常缓慢。随后作者们又对eRF3独立于eRF1的动态进行追踪，从而建立起其与核糖体之间的理解。作者们发现eRF3的结合是浓度依赖的，而且不受到核苷酸结合以及GTP水解状态的影响。

关于eRF3如何促进eRF1与终止密码子处停止作者们先前有两种模型，eRF3可能首先与核糖体结合，触发核糖体复合物重排，有利于eRF1与核糖体的后续结合。另外，eRF3可能作为分子伴侣，直接将eRF1传递到核糖体。为了对两种模型进行区分，作者们对eRF1以及eRF3的荧光进行了追踪。作者们观察到这两个因子会同时与M-Stop核糖体结合（图3）。作者们发现eRF1、eRF3和GTP将核糖体结合在一起，形成一个预三元复合物。随后GTP加速eRF3从核糖体释放，将GTP活性进行突变则会显著迟滞eRF3的释放。因此，eRF3是作为分子伴侣蛋白，将eRF1传递到终止密码子终止的核糖体上，eRF3离开核糖体部分受其GTPase活性的控制。

图3 eRF1以及eRF3共同结合促进核糖体释放

进一步的，作者们使用tRNA/eRF1 荧光共振能量转移的方法来表征肽基-tRNA键水解的动力学，重点关注翻译终止前后的核糖体上所发生的事件。作者发现eRF1在核糖体结合后3秒内诱导肽基tRNA键断裂，随后eRF1快速释放。随后作者们对终止密码子读通的事件进行检测，并对相关抑制剂潜在的临床治疗提供了新的见解。

总的来说，作者们对翻译终止过程的进行检测，从而获得该过程高分辨率视图，对翻译终止过程的动力学变化进行了全过程揭示（图3）。

• 首先，包含eRF1、eRF3以及GTP形成预结合的三元复合物结合核糖体停止在一个终止密码子处，eRF3解锁eRF1构象促进核糖体绑定。
• 接下来，eRF3水解GTP以促进其自身的释放，从而允许eRF1重排形成活性构象。被调节的eRF1随后迅速切割肽基-tRNA键，并将eRF1和释放的多肽排出。
• 对肽基-tRNA键水解的直接跟踪进一步揭示了小分子和mRNA序列抑制终止过程中的释放步骤，以促进终止密码子的读取。该工作所描述的翻译终止机制是真核生物翻译的基础，为翻译终止过程的快速与精准提供了新的分子生物学解释。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/science.abi7801

参考文献

1 Frolova, L. et al. A highly conserved eukaryotic protein family possessing properties of polypeptide chain release factor. Nature 372, 701-703, doi:10.1038/372701a0 (1994).

2 Acker, M. G., Kolitz, S. E., Mitchell, S. F., Nanda, J. S. & Lorsch, J. R. Reconstitution of yeast translation initiation. Methods in enzymology 430, 111-145, doi:10.1016/s0076-6879(07)30006-2 (2007).