揭秘小胶质细胞参与调节清醒和睡眠的作用机制

本文来源于“维真生物”

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，约占脑细胞总量的10%-15%，它们是中枢神经系统的主要防御系统，而且还参与突触的形成和消除、神经发生以及学习和记忆等，对大脑稳态和免疫起非常重要的作用。

越来越多的研究表明，睡眠/清醒状态与小胶质细胞的活性相关，但小胶质细胞是否以及如何调节睡眠/清醒尚不清楚。此外，许多神经回路与睡眠/清醒状态的调节有关，位于丘脑与大脑皮层之间的丘脑网状核(TRN)对睡眠节律的调节至关重要。最近研究表明，aTRN（TRN前端）神经元在清醒和睡眠不同阶段表现出不同的放电频率，然而调控其差异性的细胞和分子机制尚不明确。

近日，来自美国纽约石溪大学的研究团队在Nature Communications 上发表了题为“Microglia modulate stable wakefulness via the thalamic reticular nucleus in mice”的研究成果，揭示了小胶质细胞可以通过神经酰胺信号传导调节aTRN神经元的活性进行调控睡眠/清醒的状态切换。

研究者首先用他莫昔芬(TAM)和白喉毒素(DT)处理CX3CR1CreER/+:R26iDTR/+转基因小鼠，使其表达白喉毒素受体(DTR)，并使小胶质细胞对DT的敏感性加强,建立了小胶质细胞缺失模型。

利用该模型研究者发现小胶质细胞的缺失使清醒和非快速眼动睡眠（NREM）的转换增加，显著降低稳定清醒；随后通过代谢组学分析、免疫染色、生理学及化学遗传学等实验方法，作者发现aTRN神经元调节清醒和NREM的转换，小胶质细胞通过神经酰胺影响aTRN神经元活性，调节清醒稳定性。

1、小胶质细胞缺失增加了清醒和NREM的转换，降低了夜间稳定清醒

为了明确小胶质细胞对清醒/睡眠的调节作用，研究者对有/无小胶质细胞耗竭的成年小鼠的觉醒和睡眠变化进行了评估。

首先通过转基因重组联合药物（经验证，TAM和DT对小鼠睡眠结构无影响）构建了小胶质细胞缺失的小鼠模型，并对其睡眠结构进行了分析。EEG/EMG记录显示小胶质细胞缺失的小鼠表现为夜间稳定清醒时间的减少以及NREM时间增加。

进一步分析显示，小胶质细胞耗竭后，小鼠从清醒到NREM(WN)和NREM到清醒(NW)的转换次数显著增加，这说明小胶质细胞缺失后通过增加清醒与NREM的转换降低夜间稳定清醒，表明小胶质细胞在调节清醒/睡眠行为方面可能发挥重要作用，可以降低小鼠的清醒状态。

图1. 小胶质细胞对夜间稳定清醒至关重要

2、小胶质细胞耗竭消除了调节稳定清醒的神经酰胺信号的昼夜变化

为探究小胶质细胞调节夜间清醒稳定性的机制，研究者进行了代谢组学分析。

通过检测白天睡眠小鼠(Sleepday)和夜间清醒小鼠(Wakenight)脑组织的代谢物，发现155种在睡眠期和清醒期差异显著的代谢物，大多为脂质家族成员，其中神经酰胺的浓度在睡眠阶段（白天）明显高于清醒阶段（夜晚），神经酰胺浓度昼夜变化暗示了神经酰胺和睡眠之间潜在的调节作用。

随后研究者通过睡眠剥夺实验发现，睡眠剥夺12小时后神经酰胺显著增加，这表明神经酰胺随着睡眠驱动力的增强而增加。以上结果表明，神经酰胺与睡眠驱动力呈正相关，并可能通过促进睡眠来影响清醒稳定性。

图2. 神经酰胺昼夜变化与睡眠/清醒行为相关

接着，研究者对神经酰胺是否参与小胶质细胞调节的睡眠清醒行为进行了探究，评估了小胶质细胞耗竭是否影响神经酰胺的浓度。通过对小胶质细胞缺失和对照组小鼠的皮层下脑组织进行脂质测定，发现对照小鼠的总神经酰胺浓度在清醒时低于睡眠时，这与代谢组学的结果一致，而小胶质细胞缺失的小鼠中，这种变化消失了。

事实上，研究者夜间提高对照组小鼠的神经酰胺浓度时，小鼠表现为稳定清醒程度下降；而使用抑制剂降低小胶质细胞耗竭小鼠脑中的神经酰胺浓度时，小鼠表现为清醒稳定性的恢复。

综上所述，小胶质细胞可能作为神经酰胺的昼夜波动中的重要调节器，进而影响夜间稳定清醒状态。

图3. 神经酰胺介导小胶质细胞对稳定清醒的调节

3、TRN是小胶质细胞介导的清醒稳定性调节的重要脑区

接下来，研究者对小胶质细胞-神经酰胺调节夜间清醒稳定性的可能神经回路进行了探究。通过注入外源性神经酰胺提高小鼠大脑神经酰胺水平，Iba1染色观察预选脑区（MnPo、LPO、TRN、DM、SCN）的小胶质细胞形态，探索神经酰胺浓度变化对小胶质细胞形态的影响，结果发现与其他脑区相比，丘脑网状核（TRN）中小胶质细胞发生了明显的形态学改变（突起变短，Iba1表达升高），此外，研究者还在神经酰胺酶敲除（ACE3−/−）的小鼠中得到了一致的结果。

进一步验证发现aTRN（TRN前端）区小胶质细胞耗竭后，小鼠夜间清醒时间减少，清醒和NREM的转换增加，表明TRN可能是小胶质细胞介导清醒稳定性调节的重要脑区，aTRN中的小胶质细胞可以通过神经酰胺影响神经元的活动，从而调节清醒的稳定性。

为验证上述假设，研究者记录了小鼠TRN的神经元活动，发现正常小鼠的aTRN神经元在夜间的平均放电频率高于白天。通过单细胞膜片记录发现，与正常小鼠相比，小胶质细胞耗竭的小鼠aTRN神经元活动受到抑制，一致地，在正常小鼠中外源注射神经酰胺同样可以对aTRN神经元的放电能力起到抑制作用，这表明神经酰胺对aTRN神经元的活性具有抑制作用。

综合上述结果：小胶质细胞可能通过向aTRN神经元传递神经酰胺信号来调节稳定的清醒。

图4. TRN小胶质细胞对脑神经酰胺的高度敏感性

4、aTRN神经元活性调节清醒和NREM的转换

为了确定aTRN神经元如何潜在地调节清醒的稳定性，研究人员分析了aTRN神经元的夜间活性，发现aTRN神经元在清醒比在NREM时放电率更高，从清醒到NREM放电率显著降低，从NREM到清醒放电率增加。

为了探索aTRN神经元活动的改变是否影响从觉醒到NREM睡眠的转变，研究者利用化学遗传学技术，通过注射AAV病毒配合给药的方式对aTRN神经元进行激活/抑制，发现抑制aTRN神经元后增加了清醒到NREM的转换次数，减少了清醒的时间，而激活aTRN神经元后则得到了相反的结果，这表明aTRN神经元活性参与调节清醒与NREM的转换，进而影响清醒稳定性。

结合上述小胶质细胞缺失小鼠中的数据研究者得出：小胶质细胞可能通过调节aTRN神经元的活性来调节清醒稳定性。

图5. aTRN神经元活性调节清醒和NREM的转换

文末，研究人员验证了小胶质细胞缺失确实降低了清醒时aTRN神经元的活性，且aTRN神经元的激活可以恢复小胶质细胞耗竭导致的小鼠清醒稳定性的下降。

图6. 小胶质细胞耗竭后觉醒稳定性改变与aTRN神经元兴奋性的减弱有关

综上所述，研究人员证实了小胶质细胞可以通过神经酰胺信号途径影响aTRN神经元的活动，调节稳定清醒。

这一研究结果成功揭示了小胶质细胞在调节睡眠/觉醒中的重要作用，这可能有助于揭示在衰老和其他病理条件下清醒受损的潜在机制，并为其治疗提供新的思路。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-24915-x