解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析

普鲁兰酶（EC 3.2.1.41）是一类水解支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键的淀粉脱支酶，因其能专一性水解普鲁兰糖（麦芽三糖以α-1,6-糖苷键连接起来的聚合物）而得名。普鲁兰酶解开复杂结构的支链淀粉，形成直链淀粉，提高淀粉利用效率从而降低淀粉加工能耗，在淀粉相关的食品工业中应用广泛。

根据酶底物特异性和水解产物种类，普鲁兰糖水解酶分为普鲁兰酶（I型和II型）或者支链淀粉水解酶（III型和IV型）。其中I型普鲁兰酶（EC3.2.1.41）只对普鲁兰糖中的α-1,6-糖苷键具有专一性水解作用，并且麦芽三糖是其唯一的水解产物。从前期分离筛选的解淀粉芽孢杆菌发酵培养液中分离纯化得到一种适合在酸性环境下使用的耐高温I型普鲁兰酶。徐州工程学院食品与生物工程学院的高兆建、胡鑫强、陈 腾*等人主要对该酶的分离纯化，分子质量，酶学特性包括酸碱稳定性、金属离子化学试剂作用效果、底物水解专一性等方面详细阐述，旨在为该酶的进一步开发和应用提供理论依据。

1、PulBa分离纯化

DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

经硫酸铵分级盐析、透析后的粗酶液进一步离子交换层析，洗脱曲线如图1所示，得到5 个洗脱峰，其中3号洗脱峰较大，平板水解圈法定性检测显示3号洗脱峰有酶活力，1、2、4、5号峰为杂蛋白。PulBa活性主要出现在18～24管，对应NaCl洗脱浓度0.15～0.40 mol/L。合并有活性的收集管分析检测，总蛋白为17.2 mg，总活力为760.2 U，比活力为44.2 U/mg，纯化倍数5.2 倍。

Sephadex G-75凝胶过滤层析

洗脱曲线如图2所示，柱层析得到3 个大洗脱峰和1 个小峰。活性检测平板显示3号峰（100～120 min）有酶活力，其他为杂蛋白峰。各纯化步骤情况如表1所示，最终获得的纯化PulBa酶液总蛋白3.5 mg，总活力为617.7 U，比活力为176.5 U/mg，纯化倍数达到20.8 倍，回收率53.2%。纯化效果显著，比活力明显提高，说明分离纯化的介质和方法正确、高效。

SDS-PAGE分析

经柱层析后的活性样品进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示。经离子交换层析去除大量杂蛋白及色素，但SDS-PAGE仍显示含有较多杂蛋白。经两次柱层析后的样品泳道2显示单一条带，表明纯化后组分基本达到电泳纯水平，与标准蛋白对照其分子质量约为51.2 kDa。还原与非还原SDS-PAGE分析发现，PulBa在还原与非还原条件下均为同样分子质量大小的单一条带，表明酶中不存在二硫键，初步推测PulBa单亚基蛋白。非还原SDS-PAGE后凝胶经孵育酶解，卢革氏碘液染色显示单一活性条带（图3泳道3），位置与考马斯亮蓝染色条带一致，说明经两次柱层析纯化的样品泳道2单一条带为PulBa酶蛋白。

2、酶学性质分析

酶的最适温度及热稳定性

如图4所示，在30～90 ℃范围内酶活力差异显著，酶最适作用温度55 ℃，但45～70 ℃之间酶活力都在55 U/mL以上，说明PulBa适合高温反应，即使温度达到80 ℃时，仍具有高于40 U/mL的活力。不同来源的普鲁兰酶最适作用温度差异较大，Wei Wei等报道的重组普鲁兰酶40 ℃；孙利鹏等研究的耐热普鲁兰酶75 ℃，但超过80 ℃后酶活力立刻下降，85 ℃时酶活力不足50%。

如图5所示，酶热稳定性较好，40～70 ℃随着时间延长，酶活力下降缓慢，保温120 min后40、50、60 ℃和70 ℃对应相对酶活力仍保持100%、96%、91%和83%。80 ℃保温60 min还保持75%。

酶的最适反应pH值及pH值稳定性

如图6所示，最高酶活力出现在pH 4.5，在pH 3～6表现出较高酶活性，均高于60 U/mL。但pH值高于6.0时，随pH值升高酶活力急剧下降。pH 8.0时的酶活力仅为20 U/mL，说明PulBa更适合酸性环境。由图6 pH值稳定性曲线可以看出，在pH 3.0～7.0的范围中，处理6 h后酶活力都维持60 U/mL以上，说明在这些pH值条件下长时间处理对酶活力产生的影响极小，适合于长时间的使用。而在pH 7.0～8.0残余酶活力下降明显，但依旧能达到45 U/mL。

不同金属离子和化学试剂对酶活力的影响

结果可知，为确定酸根离子Cl－是否对酶活力产生影响，以NaNO3作对照，结果显示NaCl和NaNO3对酶活力均有较弱的激活作用，两者无明显区别，表明酸根离子Cl－和NO3－对酶活力没有影响。在金属离子中，Na+和K+对酶略有激活作用；激活作用最为显著的是Mg2+和Ca2+，在低浓度1 mmol/L和高浓度10 mmol/L时激活作用均偏弱，当浓度5 mmol/L时，相对酶活力分别提高至127.6%和131.9%。

底物特异性分析

如表3所示，底物为普鲁兰糖时，PulBa有最高活力，米氏常数K m 为1.34 mg/mL，最大反应速率V max 为24.6 μmol/（min·mg）；以马铃薯支链淀粉和玉米支链淀粉为底物，相对酶活力约在40%，对应K m 分别为6.54、6.10 mg/mL，V max 分别为9.5、10.7 μmol/（min·mg）；当底物为可溶性淀粉或糖原时，酶活力相近，约20%，对应K m 分别为7.9、8.3 mg/mL，V max 分别为5.1、4.5 μmol/（min·mg）。α-环糊精、β-环糊精和直链淀粉则完全没有酶活力。说明PulBa专一性水解α-1,6-糖苷键，而对α-1,4-糖苷键无水解活性，属于I型普鲁兰酶。通常，I型普鲁兰酶对分子结构中存在α-1,6-糖苷键的多糖如普鲁兰糖、支链淀粉、糖原等有广泛的底物特异性，而PulBa对普鲁兰糖表现出严格的底物特异性，对支链淀粉活性、糖原活性很弱，对其他底物无水解活性。推测PulBa是一种新型的普鲁兰酶，其结构和报道的存在差异。

结 论

本研究以前期分离筛选的解淀粉芽孢杆菌HxP-21为菌种，发酵后，通过一系列的分离纯化步骤获得了电泳纯的PulBa。经纯化比活力达到176.5 U/mg，回收率53.2%，纯化倍数20.8，整体纯化效率高。PulBa分子质量与文献报道的有较大区别。PulBa在酸性条件及较高温度下催化活力强，55 ℃、pH 4.5催化活力最高。在较高的温度范围及宽泛的酸性条件下PulBa表现出较强的稳定性。不同的金属离子、化学试剂对PulBa的激活或抑制作用与报道的普鲁兰酶相比，某些作用效果有相似性，但在很多方面存在显著差异。底物特异性研究表明PulBa是典型的I型普鲁兰酶，但在底物专一性方面又和多数报道的I型普鲁兰酶不完全相同。总的来说，PulBa在分子质量、酸碱稳定性、最适酶解条件、理化性质及底物专一性方面表现出独特的性质。尤其在热稳定性方面PulBa优势更为突出（80 ℃保温60 min酶活力还保持75%），是典型的热稳定性普鲁兰酶。PulBa有望应用于一些特定高温酸性环境的淀粉加工中或者微生物发酵、生物能源、垃圾降解等具有特殊生产环境的领域。

本文《解淀粉芽孢杆菌I型耐热普鲁兰酶的纯化及酶特性分析》来源于《食品科学》2021年42卷12期130-137页，作者：高兆建，胡鑫强，宋玉林，丁飞鸿，赵宜峰，陈腾。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200219-194。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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