腐乳丁酸及产丁酸菌发酵特性分析

肠道微生态健康是近年来备受关注的健康问题，发酵食品对微生态的影响引起世界关注，国际上对发酵食品研究已深入到肠道微生态领域。腐乳是大豆经磨浆、成坯、前酵、腌制、后酵等过程制作的传统发酵豆制品，历史悠久、风味独特、营养丰富，其中最具特色的为青方腐乳。青方腐乳又被称为“臭豆腐”，外观呈青色，更多呈豆青色，是众多腐乳种类中最具特色的一类。

南阳理工学院 河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室的马艳莉、段 哲*等人在前期确定丁酸是青方腐乳特征性风味物质，并从青方腐乳中分离鉴定出丁酸梭菌BP01的基础上，使用高效液相色谱（HPLC）法比较不同类型腐乳丁酸及其他短链脂肪酸含量，并研究青方腐乳生产过程中丁酸变化规律，对亨盖特厌氧滚管法结合分子生物学技术从青方腐乳中分离鉴定的丁酸产生菌部分发酵特性进行分析，研究结果将有利于发现富含丁酸的食品资源，并为丁酸梭菌进一步应用提供一定的参考依据。

1、青方腐乳丁酸及其他短链脂肪酸分析

结果如图1所示，青方腐乳丁酸含量明显高于其他3 种类型腐乳，其含量达到25.4 mg/g（干质量，下同），而红方、白方和低盐红腐乳丁酸含量较低，且三者之间没有显著性差异。不同类型腐乳发酵方式最大的区别在于后酵汤料中添加的辅料不同，红方腐乳诱人的红色是由于后酵过程中添加了红曲米，红方腐乳后酵汤料中还添加面曲、白酒、食盐、糖、香料等辅料；白方腐乳在生产过程中不添加红曲米，保持本色，但是添加白酒；低盐腐乳生产过程中降低了食盐使用量，添加白酒；青方腐乳与红方、白方、低盐腐乳相比后酵汤料不添加白酒，汤料中只含有食盐、黄浆水和少量花椒，没有白酒、外源蛋白酶、红曲和面曲等物质引入，使青方腐乳后酵过程微生物分布与其他3 种腐乳存在较大差异，已有研究表明，丁酸梭菌生长会受到乙醇的抑制，而青方腐乳后酵过程不添加乙醇，这可能带来青方腐乳后酵过程丁酸梭菌快速增殖，丁酸梭菌代谢产生丁酸，使青方腐乳丁酸含量显著高于其他类型腐乳。

对同一品牌的4 种腐乳样品其他短链脂肪酸含量进行测定，结果如图2所示。青方腐乳乙酸和琥珀酸（丁二酸）含量最高，与其他3 种腐乳有显著差异，但是青方腐乳乳酸含量最低，有文献报道，乳酸在丁酸菌的作用下可转化为丁酸，Bourriaud等也发现乳酸在肠道内主要转化为丁酸，所以青方腐乳的高丁酸含量可能和丁酸菌有关。白方腐乳乳酸和富马酸（反丁烯二酸）含量最高，其乳酸含量达12.95 mg/g，约是青方腐乳的68.16 倍。

2、青方腐乳生产过程中丁酸及其他短链脂肪酸含量变化

如图3所示，白坯丁酸含量较低，仅为0.45 mg/g，接种雅致放射毛霉发酵48 h后，毛坯中丁酸含量明显增加，约为白坯的5.21 倍，这与文献报道丁酸一般由微生物发酵产生一致。盐腌过程导致丁酸含量减少，这可能与食盐进入坯体引起盐坯固形物含量增加以及盐坯水分流失相关。青方腐乳后发酵前期，特别是在后酵前30 d，丁酸含量上升迅速，随后基本稳定，在后酵第45天达到最大值，约为22.47 mg/g，继续后发酵过程中，丁酸含量轻微降低。这表明，青方腐乳丁酸主要在后发酵前期产生，前期研究发现其他类型腐乳丁酸含量甚微，结合这一结论推测，不同类型腐乳丁酸含量差异由后发酵中微生物差异引起。

如图4所示，在前酵和盐腌过程中，毛坯短链脂肪酸含量最高，盐坯次之，白坯最低，这与毛坯中微生物数量较多相关，因为通常认为短链脂肪酸由微生物代谢产生。从单个短链脂肪酸含量看，毛坯中乙酸和乳酸含量最高，与白坯和盐坯有显著性差异，毛坯和盐坯中琥珀酸含量较高，与白坯有显著性差异，但是毛坯、盐坯和白坯中富马酸含量都较低。青方腐乳后发酵过程中，乙酸和琥珀酸含量虽然在发酵中期有轻微波动，但基本呈上升趋势，在后酵结束时，含量分别达18.56 mg/g和6.21 mg/g。乳酸含量在青方腐乳后酵过程中呈下降趋势，特别是后酵前30 d下降明显，导致青方腐乳后酵结束时，乳酸含量甚微，这可能与青方腐乳中乳酸在微生物作用下转化为丁酸相关。

3、丁酸梭菌BP01的部分发酵特性分析

如图5所示，菌株在RCM培养基中4 h左右进入对数生长期，菌落数指数上升，代谢产生酸性物质使培养基pH值快速下降。从培养液菌落数看，BP01在18 h进入对数生长稳定期，pH值稳定在5.8左右，而后在约24 h由于形成芽孢，pH值略有上升。

图6结果表明，BP01菌株可以利用葡萄糖和乳酸作为碳源生长代谢产生丁酸，虽然二者转化丁酸的效率不同，但是可能因为BP01菌株对两种碳源利用率有差异，所以葡萄糖和乳酸作为单一碳源的代谢终产物中丁酸累积量没有显著差异。葡萄糖和乳酸同时作为碳源时，BP01菌株代谢终产物中丁酸含量明显增加，是葡萄糖和乳酸单独作为碳源时的3 倍多，可能是由于丁酸梭菌BP01在葡萄糖作为碳源存在的情况下代谢乳酸产生丁酸的效率提高，而在乳酸存在条件下，丁酸梭菌对葡萄糖的利用率也可以得到提升，二者产生了协同效应，从而提高了BP01菌株代谢终产物中丁酸含量。

BP01菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽孢杆菌的抑制能力通过测定抑菌圈直径表示，对照组是未接种BP01菌株的RCM培养液，其抑菌圈直径为0 mm，说明对照组RCM培养液对3 种致病菌无抑制作用，而由图7可知，BP01菌株对3 种致病菌具有抑制作用，但抑菌能力有所差异，抑制大肠杆菌能力最强，与其他两种菌有显著差异，抑菌圈直径达12.5 mm。BP01菌株对蜡样芽孢杆菌抑制能力略强于金黄色葡萄球菌，但二者无显著差异。

根据腐乳食盐含量的现状，设置5、8 g/100 mL和11 g/100 mL 3 个食盐添加量，考察BP01菌株对食盐的耐受性，使用OD600 nm作为衡量标准。如图8所示，添加5 g/100 mL和8 g/100 mL食盐时，BP01菌株生长几乎不受影响，其OD600 nm对照（不添加食盐）无显著差异，当食盐添加量达11 g/100 mL时，BP01菌株的生长受到轻微抑制，其OD600 nm相对于对照下降12.34%，但仍可以较好生长，这显示BP01菌株可以耐受一定量的食盐，具有应用于含盐食品的潜力。

根据腐乳发酵温度的现状，设置20、28、37 ℃和45 ℃研究BP01菌株的温度适应性。如图9所示，在28 ℃和37 ℃条件下培养，BP01菌株生长良好，OD600 nm无显著性差异，20 ℃和45 ℃条件下，BP01菌株生长略显缓慢，其OD600 nm与37 ℃培养相比，分别降低19.08%和10.53%，但整体上，BP01菌株仍能较好生长，显示其具有一定的温度适应性。

结 论

本研究在前期确定丁酸是青方腐乳关键风味物质的基础上，分析青方腐乳丁酸及变化规律，进一步研究从青方腐乳中分离鉴定的产丁酸菌的部分发酵特性，得出如下结论：1）青方腐乳富含丁酸，其含量远高于红方、白方和低盐红腐乳，可作为丁酸潜在的消费载体。2）丁酸主要在青方腐乳后酵前30 d产生，与青方腐乳后酵过程中丁酸梭菌密切相关；青方腐乳乳酸含量较低，并且在后酵过程中呈下降趋势，可能在特定微生物作用下转化为丁酸。3）在前期实验从青方腐乳中分离鉴定丁酸产生菌的基础上，研究了高产丁酸的丁酸梭菌BP01部分发酵特性，结果表明其培养过程中较快进入对数生长期，在培养18 h后进入生长稳定期，终产物pH值在5.8左右，能利用乳酸作为碳源；BP01菌株抑制大肠杆菌能力最强，对金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌也有抑制作用，能够耐受一定浓度的食盐，并表现出一定的温度适应性，有应用于腐乳发酵潜力。

本文《腐乳丁酸及产丁酸菌发酵特性分析》来源于《食品科学》2021年42卷10期58-64页，作者：马艳莉，段哲，梁静静，李素萍，丁玉峰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200210-083。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网

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