冷冻电镜样品的纯化怎么做，看了这篇文章你就知道了

■背景

2013 年以来，冷冻电镜结构解析数量成快速增长的趋势，主要得益于 DDD 照相技术、图像自动收集和图像处理算法的进步。很多超大蛋白复合物和膜蛋白，仅需微量样品即可利用冷冻电镜技术得到了结构三维重构解析，突破了 X 射线晶体学结构解析需要大量外源表达和需要结晶的条件限制。

冷冻电镜具有三种常见的样品类型：膜蛋白、蛋白质复合物、病毒颗粒。

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膜蛋白

由于膜蛋白的表达成功率很低，需要对膜蛋白进行大量的截短体，突变体的外源表达筛选，膜蛋白与 GFP 融合蛋白的方式选择，或者利用抗膜蛋白融合标签的抗体与 GFP 融合蛋白的方式配合荧光检测和分子筛联用技术，通过以上方式可以在细胞上清液中直接鉴定表达量和聚合状态，无需层析纯化。

膜蛋白成功表达后处于细胞膜上，需要在层析纯化之前，将膜蛋白从细胞膜上溶解下来形成单分散的形态，常用的溶解试剂包括：去垢剂及去垢剂混合物、脂质体、纳米磷脂盘 Nanodisc、膜蛋白稳定剂等。

膜蛋白从细胞膜溶解下来后进行层析纯化，通常选择使用 strep、flag 等特异性极高的亲和标签进行捕获，后用 Superdex increase 或者 Superose increase 进行分子筛精纯。

纯化后的蛋白还可以进一步尝试 Nanodisc 的组装，冗余的去垢剂也需要进一步通过密度梯度离心去除才能完成冷冻电镜制样。对于膜蛋白复合物可以通过同时完成亚基之间的交联，使得样品更加刚性，提高重构的分辨率。某些膜蛋白具有合适的纳米抗体，经 protein A 抗体亲和柱纯化后加入膜蛋白中，使得分辨率进一步提高。

蛋白质复合物

蛋白质复合物可以通过分别表达和纯化再混合组装，或者通过共表达方式在表达细胞中同时表达组装再进行纯化。

复合物中多亚基均可以带亲和标签，使得在层析纯化过程中使用多步亲和层析纯化纯度提高。由于复合物亚基之间的摩尔比例决定了复合物的均一性，高分辨率离子交换如 Mono 和 Capto HiRes 预装柱能够实现一个亚基差异的复合物间的分离，之后再进行分子筛的精纯。

为了提高结构的分辨率，蛋白质复合物需要在冷冻电镜制样之前进行密度梯度离心交联，保证复合物的刚性。

病毒颗粒

冷冻电镜结构的病毒颗粒样品一般在宿主细胞中感染增殖后，通过密度梯度离心进行分离。Cytiva 也具有专为病毒颗粒样品层析纯化使用的 Capto Core 预装柱，适合直径 25 nm 至 100 nm 以上的各种病毒颗粒样品的精细纯化。

ÄKTA pure micro 微量层析系统

冷冻电镜结构解析要求样品量很低，因此很多难以大量表达纯化的蛋白，可以在真核细胞体系，或者从天然生物体中直接微量提取，实现结构的解析。

ÄKTA pure micro 微量层析纯化系统专为这类微量体积样品纯化设计，配合 cytiva 的微量层析预装柱，实现微量体积样品的精细分离和高回收率。同时微量系统还可以帮助密度梯度离心交联后的样品，进行 UV 的检测和微量体系的分装收集。尽最大可能保证冷冻电镜制样前样品具有极高的纯度和均一性和极高的回收率，并降低表达的成本和精力。

内容审核：刘果、周育红

题图来源：站酷海洛