C9orf72缺失促进小胶质细胞介导的衰老

C9orf72重复扩增会导致遗传性肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)和额颞叶痴呆(frontotemporal dementia, FTD)，并导致C9orf72蛋白表达缺失，潜在毒性RNA和双肽重复蛋白的产生。除ALS/FTD外，C9orf72重复扩增已被报道出现在一系列神经退行性综合征中，其中包括阿尔茨海默病。

据此，加州大学和西达赛奈医疗中心的研究人员于近日在《Neuron》发现：C9orf72缺失促进了小胶质细胞内稳态特征的改变，并向炎症状态的转变，其特征是I型干扰素（IFN）特征增强。

C9orf72缺失的小胶质细胞可以触发年龄依赖的神经元缺陷，特别是增强皮质区突触修剪，导致小鼠学习和记忆行为的改变。有趣的是，在淀粉样蛋白积累的小鼠模型中，C9orf72缺陷的小胶质细胞促进了突触丧失和神经元的缺陷，然而却改善了淀粉样斑块的清除。

这些发现表明，C9orf72表达的降低导致小胶质细胞功能的改变，直接导致重复扩增载体的神经退行性变，而且不依赖于功能获得毒性。

1.C9orf72缺陷的小胶质细胞显示出转录特征改变和炎症状态增强

为了研究C9orf72缺失是如何改变小胶质细胞功能的，作者首先对来自青年(3个月)或老年(17个月)C9orf72+/+、C9orf72+/-和C9orf72-/-小鼠的Cd11b+的小胶质细胞进行了RNA测序。主成分分析(PCA)显示，所有基因型在3月龄时出现聚集，但在17月龄时，C9orf72-/-小鼠与C9orf72+/+和C9orf72+/-/动物出现分离。

作者前期结果显示，C9orf72-/-小胶质细胞3月龄时显著上调的单基因表达模块，在17月龄的C9orf72-/-和C9orf72+/-均出现上调。此模块中的基因包括炎症小体成分以及参与MHCII抗原呈递的内吞酶体成分，这说明C9orf72在小胶质细胞的抗原呈递和炎症中起关键作用。

最近一些研究的RNA-seq结果显示C9orf72-/-中稳态小胶质细胞标志物相比于WT小鼠减少，但I型干扰素应答小胶（interferon response microglia，IRM）的标志物和细胞因子水平升高。为了确定C9orf72-/-小胶中的转录水平的变化，作者对12个月龄的C9orf72+/+、C9orf72+/-和C9orf72-/-小鼠的皮质小胶质细胞进行了单细胞RNA测序（single cell RNA-seq）scRNA测序。

聚类分析显示所有基因型的16个小胶质细胞亚群，并且富含ARM基因簇(cluster 11)和IRM基因簇(cluster 13)的是两群完全不同的细胞亚型。同时，模块分数分析显示，在C9orf72+/-和C9orf72-/-中这两个模块的ARM分数都有所下降，但IRM模块得分均增加。这些数据证实了验证了之前RNA-seq的观察结果，即C9orf72-/-小鼠的ARM基因表达降低，IRM基因表达增加。

为了研究C9orf72-/-小胶质细胞也显示I型IFN反应和下游干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的变化，作者进行了分子水平检测，发现小胶质细胞在GMP-AMP (cGAMP)刺激下基础STING蛋白水平升高，且ISGs中的CXCL10和Mx1基因的产生增强。

这些数据表明，小胶质细胞中C9orf72的缺失导致年龄依赖性的ARM基因表达减少和IFN应答基因表达增加，这可能是由STING活性增强驱动的。

C9orf72−/−小鼠的小胶质细胞转录组谱改变

2.老年C9orf72−/−小鼠表现出溶酶体缺陷、小胶质细胞增生和运动皮层突触末端补体介导的剪切功能增强

因为小胶质细胞是大脑中C1q的主要来源，并且在衰老和神经退行性疾病中可以观察到C1q表达增加，因此作者对补体蛋白C1q进行免疫染色，发现C9orf72−/−小鼠相对于WT小鼠来说，其运动皮质中C1q的免疫反应性显著增加。

作者还观察到12个月时皮质突触蛋白显著减少，通过免疫染色和免疫印迹评估，突触素（synaptophysin），vGLUT1和PSD95显著减少。值得注意的是，杂合动物在12个月时C1q、突触素和vGLUT1水平没有明显变化。

另外，C9orf72−/−鼠中补体沉积增加，突触标记物减少，同时树突状分枝和神经突起长度明显减少。这些结果说明C9orf72基因的完全敲除可以导致突触和神经元形态的明显异常。

为了进一步确定补体沉积和突触丢失之间的关系，作者在WT及C9orf72−/−鼠的运动皮质中共同标记了C1q和vGLUT1，结果显示C9orf72−/−中C1q与vGLUT1+的共标记斑点显著增加，而此现象在这个年龄(12个月)的WT小鼠中是很少观察到的。

作者还发现在C9orf72−/−小鼠中Iba1+的小胶质细胞中vGLUT1和PSD95的积累显著增强，说明它们吞噬了突触。为了研究C9orf72−/−中的突触丢失是否导致这些动物行为异常，作者使用巴恩斯迷宫(Barnes maze，BM)来检查小鼠的空间学习和记忆能力。

结果发现，C9orf72+/+、C9orf72+/-小鼠在测试过程中显示了潜伏期时间的稳定减少，这表明这些动物进行了空间学习。然而，C9orf72−/−发现逃生通道的潜伏期时间增加了，说明其空间记忆受损。

综上这些结果说明，在老年小鼠中，C9orf72−/−小胶质细胞导致了异常的神经元树突状形态和补体介导的突触丧失，从而导致认知缺陷。

老年C9orf72−/−小鼠的突触损伤和行为缺陷

3.小胶质细胞中C9orf72的缺失再现了C9orf72-/-小鼠中观察到的突触表型

为了确定C9orf72重复扩增本身是否会影响神经元的突触结构与功能，作者将WT和C9orf72-/-神经元进行原代培养14天，结果发现，在单培养神经元的情况下，无论是突触前蛋白(synaptophysin，vGLUT1和Bassoon)还是突触后蛋白(Homer和PSD95)在WT和C9orf72-/-神经元之间的表达模式都没有改变。这些结果表明，在体外基础条件下，C9orf72的缺失不会导致皮层神经元中突触蛋白水平的任何显著变化。

接下来，作者将WT和C9orf72-/-小胶质细胞添加到原代培养的WT皮质神经元（已培养14天）中，并维持2天，然后对所有培养物固定并进行免疫染色和分析。

结果显示，与WT神经元/WT小胶质细胞相比，WT神经元/C9orf72-/-小胶质细胞共培养的突触素密度下降，提示C9orf72-/-细胞的吞噬功能增加。另外，作者发现C9orf72-/-小胶质细胞中突触素阳性的斑点明显增加，也印证了这一点。

C9orf72−/−小胶质细胞突触剪枝和吞噬作用增加

为了进一步评估C9orf72缺失在小胶质细胞中的作用，作者在研发了一种骨髓亚群体中选择性耗尽C9orf72的C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+小鼠，包括在小胶质细胞中的C9orf72。对12个月大的C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+小鼠的运动皮质进行分析，发现小胶质细胞中有CD68+溶酶体聚集，重现了C9orf72完全敲除小鼠中观察到的表型。

同时，作者还发现C1q表达增加，突触素和vGLUT1水平下降，与C9orf72全敲除表型相似。对C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+小鼠的C1q和vGLUT1双免疫染色显示，C1q沉积在vGLUT1+斑点附近，这些结论支持了这些突触是被清除的。

最后，在C9orf72fl/fl:Cx3cr1cre+动物的小胶质细胞中发现vGLUT1+和PSD95+斑点数量增加。总之，这些结果支持了小胶质细胞中C9orf72缺失会自主驱动吞噬活性并诱导神经元突触缺失。

小胶质细胞特异性c9orf72敲除小鼠的突触剪切能力增强

4.在AD小鼠模型中，C9orf72−/−小胶质细胞清除淀粉样斑块能力增强

为了评估C9orf72缺失对淀粉样蛋白病理的影响，作者将C9orf72−/−小鼠与5XFAD转基因小鼠杂交。5XFAD转基因小鼠是一种淀粉样蛋白沉积模型，以前曾用于检测改变的小胶质功能对Aβ积累的影响。

由于该模型在3个月后迅速积累Aβ，6个月时斑块负荷较大，因此作者在5XFAD、5XFAD/C9orf72+/−和5XFAD/C9orf72−/−小鼠的冠状切片上对Aβ聚集物进行染色，发现6个月时5XFAD/C9orf72−/−小鼠与其他基因型相比，皮质和海马区的Aβ和淀粉样斑块积累明显减少。

在6个月时，小胶质细胞的总数在不同基因型中是类似的。然而5XFAD/C9orf72−/−小鼠的斑块比5XFAD鼠更小、更致密。且在5XFAD/C9orf72−/−中有更多的小胶质细胞聚集在斑块周围。

C9orf72基因减少会改变淀粉样斑块沉积和小胶质细胞吞噬斑块的功能

5.5XFAD/C9orf72−/−小鼠小胶质细胞介导的突触修剪增强

作者接着研究了C9orf72−/−小胶质细胞如何改变其功能和炎症特性，及如何影响5XFAD斑块积累过程中的突触完整性。因为在4个月时5XFAD小鼠淀粉样斑块只是最近才积累，而没有神经元损失。因此作者观察了4个月时5XFAD/C9orf72−/−动物突触素和vGLUT1以及突触后标记物PSD95的表达情况，发现其表达均减少。

为了确定增强的突触丧失是否是由补体介导的剪接引起的，作者对C1q和vGLUT1进行了共染色，发现与5XFAD相比，5XFAD/C9orf72−/−小鼠的运动皮质中C1q和vGLUT1双阳性斑点增加。作者还观察到5XFAD/C9orf72−/−小鼠中Iba1+小胶质细胞内vGLUT1+和PSD95+物质的积累增强，进一步证实小胶质细胞吞噬突触蛋白。

为了确定在5XFAD/C9orf72−/−双转基因小鼠中是否存在与增强的早期突触丢失相关的行为，作者进行了BM试验。发现5XFAD/C9orf72−/−小鼠与其他所有基因型(包括5XFAD)相比，首次潜伏期增加，而通常在这个年龄只有轻微的损害。这表明C9orf72缺陷加重了这些动物的空间学习和记忆缺陷。

总之，这些数据表明，在AD小鼠模型中，C9orf72−/−小胶质细胞功能状态的改变抑制了细胞外淀粉样斑块生长的能力，同时也增强了突触丧失、记忆缺陷和神经元损伤。

5XFAD/C9orf72-/-小鼠的小胶质细胞中溶酶体积累增多，神经元和突触缺陷增加

参考文献

Deepti Lall, Ileana Lorenzini, Thomas A. Mota, C9orf72 deficiency promotes microglial-mediated synaptic loss in aging and amyloid accumulation, Neuron, 2021, ISSN 0896-6273

编译作者：Sheena(brainnews创作团队)

校审：Simon（brainnews编辑部）