解密多巴胺能突触发育

脑内多巴胺的转运对动机，运动和情绪都起着重要的调控作用，然而不同于对谷氨酸能和GABA能突触发育的研究，对多巴胺能突触发育的了解还十分有限。

来自美国凯斯西储大学的Lin Mei教授团队，发现多巴胺神经元上的Neuregulin3与中型多棘神经元上的Caspr3发生反式相互作用，调控多巴胺能神经元上bassoon簇的发育，该研究成果近期发表在Current Biology上。

中脑多巴胺能（Dopaminergic，DA）神经元能够投射到纹状体的中型多棘神经元（Medium spiny neurons，MSNs)上，调控运动活动性，强化学习和动机。这种特异性的功能环路通过发育过程中突触大量形成和随后修剪来最终形成。然而，目前对于DA功能性投射发育过程中的调控机制了解还十分有限。

作者首先检测了发育过程中DA投射的表达变化。因为DA神经元在纹状体中形成密集的神经投射，这使得在体内研究它们的发育十分困难。

为此，作者使用蛋白质组放大分析（Magnified analysis of the proteome，MAP）技术，分析了发育期间腹侧被盖区（Ventral tegmental area，VTA）投射到纹状体MSNs上DA轴突中的Bassoon (BSN) 簇（突触前的一种蛋白）的表达，来反映DA投射神经元的数量。

结果显示从P0-P10纹状体DA神经元中的BSN簇（BSN+TH+）的密度先增加然后下降，表明在发育过程中纹状体中的DA突触首先大量形成然后被修剪。

为了了解这个过程的内在机制，作者对影响BSN簇表达的分子进行了筛查。qRT-PCR分析显示P3小鼠NRG3, 一种NRG家族的跨膜营养因子，的mRNA水平是P60小鼠的8倍，进一步使用patch-seq和western的方法证实了NRG3的变化；在体原位杂交结果显示在VTA/黑质致密部 (Substantia nigra pars compacta，SNc)区域内99%的DA神经元中都表达NRG3 mRNA，且其表达在伏隔核核部（Nucleus accumbens，NAcc）也被检测到；与此同时，NRG3和DA轴突上BSN簇的发育时间进程几乎重合。

合在一起，这些结果表明DA神经元中NRG3与BSN簇的表达紧密相关，而NRG3可能在DA突触发育中起到调节作用。（Fig 1）

Fig 1 NRG3是影响DA轴突上BSN簇在关键期发育的重要分子

以上结果显示NRG3和BSN簇的表达紧密相关，那么是否NRG3的敲除会影响BSN簇的表达呢？为了探究这一问题，使用了在DA神经元中特异性敲除NRG3的小鼠---DAT-Nrg3f/f小鼠，并使用超分辨率成像的方法对NRG3敲除小鼠的DA轴突上BSN簇的表达进行检测。

结果显示，对照组小鼠DA轴突BSN簇的数量在P10达到峰值，在P60相对下调，而突变体小鼠在P0和P10的BSN簇数量与对照组没有明显区别，而在P60，DA神经元上BSN簇的数量相比于对照组明显增加，这一结果提示NRG3不影响DA突触的形成，而可能会参与到DA突触的修剪。（Fig 2）

Fig 2 DAT-Nrg3f/f小鼠DA轴突上BSN簇数量增加

既然NRG3参与到DA突触的修剪，那么NRG3在这个过程中是如何发挥作用的呢？作者推测NRG3可能与MSNs上的跨膜蛋白发生反式相互作用来发挥作用。为了验证这一点，将NRG3-ECD与碱性磷酸酶 (AP) (NRG3-ECD-AP) 融合作为诱饵筛查了400个跨膜蛋白文库。

通过这种筛查方法检测到一种新型蛋白Caspr3能够与NRG3发生相互作用：当NRG3-ECD-AP和Caspr3-ECD-Fc重组蛋白混合时，使用抗Caspr3抗体在沉淀物中能够检测到NRG3-ECD，证明Caspr3与NRG3能够发生相互作用；而从Nrg3f/f 小鼠纹状体匀浆中也检测到了Caspr3 的沉淀物，表明这种相互作用能够在体内发生。

但是这种相互作用可能是发生在同一个细胞上的顺式相互作用，也可能是发生在两个细胞上的反式相互作用，为了探究这一问题，作者进一步使用了细胞聚集测定法。

结果显示，当分别表达Caspr3（带有绿色荧光GFP）的细胞和NRG3(带有红色荧光蛋白RFP)的细胞混合时，含有两种荧光的细胞聚集物增加，提示Caspr3这种新型蛋白能够与NRG3发生反式相互作用。（Fig 3）

Fig 3 Caspr3与NRG3发生反式相互作用

最后，作者提出是否突触前的NRG3与突触后Caspr3的反式相互作用能够防止DA到MSNs的投射过度形成呢？为了探究这一问题，作者使用Caspr3-ECD来在体的破坏NRG3-Caspr3之间的相互作用。

具体来说，使用电穿孔法在P0小鼠的双侧纹状体中导入携带或不携带Caspr3-ECD的GFP质粒，使部分小鼠纹状体神经元上表达Caspr3-ECD，从而达到在体减少表达NRG3和Caspr3细胞聚集的目的。

结果显示，Nrg3f/f小鼠Caspr3-ECD的表达会导致DA神经元到MSNs上投射的增加，说明突触前的NRG3与突触后Caspr3反式相互作用能够防止DA到MSNs投射的过度形成。(Fig 4)

Fig 4 破坏NRG3-Caspr3的相互作用增加DA轴突到MSNs上的BSN簇

合在一起，这些结果表明DA突触的发育受到DA神经元中NRG3和MSNs中Caspr3的相互作用的控制，揭示了大脑环路连接过程中NRG3-Caspr3这一对新的细胞黏着分子。

参考文献

W. Cui, N. Gao, Z. Dong, C. Shen, H. Zhang, B. Luo, P. Chen, D. Comoletti, H. Jing, H. Wang, H. Robinson, W.C. Xiong, and L. Mei. In-trans neuregulin3-Caspr3 interaction controls DA axonal bassoon cluster development. Current Biology, in press, 2021

编译作者：晨述（brainnews创作团队）

校审：Simon（brainnews编辑部）