血浆胺氧化酶交联明胶及其产物结构表征与性能分析

明胶是由来源于动物的皮肤、骨头等结缔组织中的胶原蛋白水解而得到的一种天然生物大分子，分子质量为几万到几十万不等。由于其具有良好的发泡和乳化能力、优良的成膜特性、高水结合能力、较好的生物相容性和良好的生物降解能力等，明胶被广泛应用于食品、制药和化妆品等行业中。在明胶制备过程中，由于受到酸、碱和热的作用，原有胶原蛋白分子的三股螺旋结构受到不同程度的破坏，因此所形成的明胶凝胶强度在很多时候不能完全满足食品加工的需求。

天津科技大学食品科学与工程学院的刘新柱、程 珊、王稳航*等人以明胶为对象，利用不同添加量血浆胺氧化酶（PAO）有无Cu2＋辅助交联条件下对其交联，研究交联后明胶结构和功能特性的变化。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、扫描电子显微镜（SEM）、差示扫描量热（DSC）仪、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、Zeta电位测定、流变性能分析、粒径分析、荧光分光光度等仪器方法对PAO交联明胶的二级结构及变化进行分析，所得结果将为进一步研究PAO作为新型的食品蛋白质交联酶提供支持。

1、SDS-PAGE分析

如图1所示，交联后的明胶分子链在γ处位置颜色更深，不符合明胶的三螺旋结构，即不符合含有少量的γ链、β链与含量较多的α链。推测在γ处PAO里的杂蛋白和γ链重叠形成遮挡，造成颜色发深。不加入Cu 2＋ 时，随着酶活力的增加，明胶大分子质量条带逐渐加深，使大分子质量组分增加。但是与纯胶原条带相比整体条带颜色较浅，这可解释为明胶发生了部分降解，但仍然保留部分三螺旋结构。当加入Cu2＋时，与不加Cu2＋的样品相比，所有条带颜色均变浅，部分大分子质量条带甚至消失，这说明加入100 mmol/mL Cu2＋条件下可能会使明胶变性而酶活力也会受到影响，无法形成有效的结合，因此加入浓度为100 mmol/mL的Cu2＋效果并不是很理想。

2、SEM分析

由图2可以看出，纯明胶（对照品）呈现较松散的结构，层次结构中有较多的空隙存在，并且内壁较厚且光滑。随着PAO的添加（不加入Cu2＋），明胶的结构变得越来越紧密，结构空隙也越来越小，当酶活力增加到100 U/g时，明胶表面的结构最为致密并且光滑，看不到层次结构，这可以解释为PAO可以与明胶发生交联，最终使明胶的网络结构变得更为致密。当加入Cu2＋后，纯明胶的结构变得更为松散，这可能是因为在加入Cu2＋条件下，明胶发生变性，导致其结构变得疏松；同时，随着酶含量的增加，明胶的网络结构也呈现一定程度的紧密，但是层状结构并不明显，并且明胶网络比未加入Cu2＋的样品空隙大，这说明在100 mmol/mL Cu2＋存在条件下，Cu2＋可能会阻碍酶与明胶的交联，未交联的酶填充到明胶的网络结构中，使结构变得紧实，但这并不排除其他适宜浓度的Cu2＋促进明胶与酶发生交联的可能性，包括明胶中原有的金属元素也可能通过提高PAO酶活性促进了交联。

3、DSC分析

从表1和图3可以看出，在不加入Cu2＋时，峰值温度与焓变的变化趋势保持一致，这说明酶的加入能够使明胶的网络结构变得更加稳定；随着PAO添加量的增加，PAO与部分解螺旋结构的明胶发生交联并且会增加分子间作用力，因此破坏其结构需要更多的热量。当加入Cu2＋时，Tm与ΔHm的变化趋势均与未加入时趋势相反，Cu2＋会破坏酶与明胶的结构，使其发生变性，无法产生相互交联作用及分子间相互作用。这一结果也与电泳和SEM结果一致。在50 U/g＋Cu2＋时焓变最大，这可能由于该添加量为明胶分子间交联及Cu2＋与部分带负电荷的基团发生静电相互作用的合适添加量；而随着PAO添加量的增大，PAO会干扰明胶的空间结构，明胶分子逐渐变的不稳定，破坏其结构需要的热量减少。

4、FTIR分析

不同处理明胶样品的FTIR如图4所示，参照已有研究方法，其二级结构中酰胺I带的不同结构含量分析如表2所示。明胶的酰胺I带（1 700～1 600 cm-1）是分析其结构发生显著变化的重要特征带，明胶的结构越稳定，则酰胺I带中的无规卷曲结构含量越少，而β-折叠、α-螺旋和β-转角等规则结构含量增加，反之，明胶的网络结构变得不稳定，无规卷曲含量增加。在不加入Cu2＋时，随着PAO添加量的增大，无规卷曲含量显著增加，β-折叠和β-转角先减少后增加，α-螺旋先增加后减少，这可能是由于不同含量的酶与明胶的多肽链发生不同程度的交联，并且产生不同含量的次级键，使明胶中的肽链发生聚合，形成稳定的二级结构。

5、Zeta电位分析

从图5a可以看出，在不加入Cu2＋时，电位整体偏向于负值，说明该明胶为酸性明胶。随着PAO添加量的增加，电位逐渐趋向于负值，说明酶的加入与明胶中存在的酸性基团发生有效结合，PAO氧化端肽的碱性赖氨酸形成α-氨基脂肪-δ-半醛，随后与另一个氨基或者醛形成共价交联，形成的网络结构呈现酸性。如图5b所示，当加入Cu2＋后，明胶的整体电位呈现中性，并且不同含量的明胶电位无明显变化，这说明Cu2＋的加入与明胶及酶之间发生静电相互作用，并且会破坏明胶分子结构，使酶变性，阻碍明胶分子的相互作用。

6、流变性能分析

如图6所示，纯明胶为典型的牛顿流体，随着酶含量的增加，明胶的牛顿流体行为减弱，而表现出假塑性，这可能是由于明胶与PAO的相互作用的原因。G′大于G′′，说明体系以弹性为主，反映明胶的凝胶特性。当加入Cu2＋后，明胶的弹性模量和黏性模量均呈现增大的趋势，且随着剪切频率的增大而增大，呈现线性相关，说明Cu2＋的存在影响明胶的网络结构，使明胶的凝胶特性提高，这可能是由于Cu2＋与明胶发生静电相互作用的结果。

7、粒径分析

从图7可以看出，在未加入PAO时，明胶主要分布在小分子质量范围内（0.764～0.850 μm），而在大分子质量分布范围内（18.97～61.61 μm）含量较少。随着PAO添加量的增加，明胶小分子含量逐渐减少，而大分子含量增加，说明酶的加入使明胶分子发生交联，纤维之间相互聚合，分子内氢键及相互作用力等增加，使明胶的结构紧密，最终使分子质量增加。这一结果也与前面的电泳分析结果一致。当加入Cu2＋后，小分子质量比未加入Cu2＋时减少，而大分子质量增加，这说明Cu2＋的加入可以与明胶分子链发生结合，使分子链增大，从而大分子质量增加。

8、荧光分析

从图8可以看出，所有样品显示2 个不同的峰，分别为400～450 nm与700 nm波长处左右的峰（其中700 nm波长处的峰为倍频峰，在这里不做分析）。从图8a可以看出，随着PAO添加量的增加，明胶的荧光强度呈现先增加后减少的趋势，并且在PAO添加量为25 U/g时荧光强度最大，这可以解释为在PAO添加量为25 U/g时酶与明胶交联产生的荧光性物质含量最多，即交联强度最大；随着PAO添加量的继续增加，过多的酶可能填充到交联的网络间隙，对荧光性物质产生阻碍，因此荧光强度减小。

结 论

本实验以PAO作为交联剂对明胶分子进行酶法改性，分析了酶处理后明胶的分子质量、分子结构和相关性能的变化。SDS-PAGE结果显示，随着加入PAO添加量的增大，蛋白质大分子质量条带含量增加，表明明胶分子间发生了交联。同时，从SEM图可以看出，发生交联后的明胶结构由松散变得越来越紧密，结构空隙越来越小，网络结构更为致密。FTIR分析结果表明明胶由于分子间交联而逐渐形成了稳定的二级结构。DSC结果表明加入PAO后明胶网络结构的热稳定性有提高。更为重要的是，流变性能与粒径分析的结果表明随着PAO添加量的增多，明胶聚集度逐渐增加，颗粒不断增加，进而提高明胶的黏弹性。荧光分光测定结果显示，明胶的荧光强度呈现先增加后减少的趋势，在PAO添加量为50 U/g时荧光强度最大，交联的效果最好。此外，与对照组相比，添加100 mmol/mL Cu2＋并不能对交联起到积极的作用，反而会对交联起到阻碍作用。研究结果表明在无Cu2＋作为辅助因子的情况下PAO也能够交联明胶分子并对其性能的改良具有积极的效果，初步证明了PAO作为新型的氧化酶交联食品蛋白质的可能性，其具体机制包括辅助因子的确切影响以及PAO对其他蛋白质的交联效果仍需进一步研究。

本文《血浆胺氧化酶交联明胶及其产物结构表征与性能分析》来源于《食品科学》2021年42卷8期22-28页，作者：刘新柱，程珊，李玉，王稳航。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200318-278。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

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修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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