单碱基编辑在非人灵长类动物中的首次应用将预防心血管疾病

撰文 | 木兰之枻

责编 | 兮

CRISPR-Cas9/Cas12为代表的基因编辑技术正成为疾病治疗的热门策略。这其中可实现A·T--G·C碱基对转换的新型单碱基编辑器ABE（Adenine Base Editor）的出现，让高效精准的基因编辑成为可能【1】（详见BioArt报道：突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC），也成为多种疾病治疗的热门工具。虽然ABE工具已在小鼠疾病模型的治疗研究中取得众多成果（详见BioArt报道：Nature | 刘如谦团队在单碱基编辑技术治疗早衰症中取得新突破）【2】，但其在非人灵长类动物模型中的递送效率和治疗效果依然缺少研究，这也限制了单碱基编辑技术在临床治疗中的应用。

2021年5月19日，来自美国Verve Therapeutics公司的Sekar Kathiresan团队在Nature发表题为In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates的论文。文章利用单碱基编辑工具ABE和脂质纳米颗粒（LNPs）在非人灵长类模型中实现了PCSK9基因剪接位点的精准编辑。研究指出，该策略只需单次注射便可持久抑制肝脏中PCSK9基因的表达，最终有效降低血液中PCSK9和低密度脂蛋白的水平。本研究为心血管疾病的预防提供了全新的思路。

研究者选择单碱基编辑工具ABE8.8用于PCSK9基因剪接位点的精准编辑以实现PCSK9表达的持久抑制。根据ABE8.8的活性窗口和PCSK9剪接受体/供体位点的序列特征，研究者设计出20种PAM序列为NGG的gRNAs。随后研究者通过LNPs转染ABE8.8 mRNA/gRNA的方式在人原代肝细胞中筛选最优gRNA。结果显示，靶向PCSK9基因1号外显子剪接供体的PCSK9-1 gRNA效果最佳，编辑效率可达60%。由于PCSK9-1 gRNA的靶位点在人与食蟹猴基因组中高度保守，研究者在食蟹猴原代肝细胞中进一步证实了PCSK9-1gRNA的有效性。此外，小鼠Pcsk9基因在该位点具有高度的同源性，也存在适合ABE8.8的gRNA PCSK9-1m（与PCSK9-1存在4碱基错配）。因此研究者利用LNPs和ABE8.8 mRNA/ PCSK9-1m gRNA，通过静脉注射的方式在小鼠体内验证该策略的有效性。结果显示注射一周后，小鼠肝脏中靶位点的编辑效率可达70%。

之后研究者在食蟹猴中对LNPs和ABE8.8 mRNA/PCSK9-1 gRNA的编辑效果进行更系统的检验。预实验结果显示，以1.0 mg/kg的剂量注射LNPs两周后，食蟹猴肝脏中PCSK9靶位点的编辑效率可达63%。与此同时，血液中PCSK9蛋白也降低了81%，低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平也降低了65%，这表明LNPs和ABE8.8 mRNA/PCSK9-1 gRNA可实现食蟹猴肝脏中PCSK9靶位点的高效精准编辑并具有潜在的治疗意义。研究者还指出，该策略具有明显的组织特异性：其在肝脏中的编辑效果最为明显，此外仅脾脏和肾上腺中有低水平的编辑效果。随后的剂量效应实验发现，LNPs在0.5、1.0和1.5 mg/kg的剂量下对PCSK9靶位点的编辑效率均>50%，且剂量≥1.0 mg/kg时，编辑效率、PCSK9和LDL胆固醇的降低均趋于饱和。此外，LNPs注射会导致食蟹猴肝脏功能指标AST和ALT的短时中度上升，但一周后便可恢复正常。研究还发现，大部分的LNPs组分在食蟹猴循环系统中存留的时间不超过两周，而ABE8.8 mRNA/PCSK9-1 gRNA在注射后48小时后便快速降解，一周后便被清除干净。

随后研究者还开展了一项持续至今的长期研究，以3.0 mg/kg的LNPs剂量检验食蟹猴对单碱基编辑的药物耐受性，以及PCSK9基因编辑后PCSK9和LDL胆固醇水平降低的持久性。结果显示，LNPs注射1周后，血液中PCSK9水平便可降低近90%，血液中LDL胆固醇和脂蛋白的水平则分别降低60%和35%，且这种降低可持续至少8个月。长期研究还指出，LNPs注射后，AST和ALT会有瞬时中度上升，但两周后便可恢复正常。除此之外，实验中的食蟹猴并无其它肝功能异常和健康异常。

已知单碱基编辑工具在DNA水平和RNA水平可能存在不同程度的脱靶风险。为此，研究者首先在食蟹猴原代肝细胞和肝脏组织样本中对LNPs和ABE8.8 mRNA/PCSK9-1 gRNA在DNA水平的脱靶效应进行分析。借助于新的脱靶分析策略ONE-seq【3】，研究者共发现48处潜在的脱靶位点，定向PCR扩增测序结果显示，肝细胞和肝脏组织中的脱靶效应相似，且仅1处位点有较明显的脱靶效应但脱靶位点的编辑效率<1%。随后研究者还通过ONE-seq和Digenome-seq两种脱靶分析策略在4种不同供体来源的人原代肝细胞中分析脱靶效应，结果显示两种策略发现的数十处脱靶位点均无明显的脱靶效应。研究者还对该策略在RNA水平的脱靶效应进行分析，结果发现其在RNA水平并无明显的脱靶效应。以上结果表明，非人灵长类动物中，通过LNPs递送的ABE单碱基编辑有较高的安全性。

此外，来自瑞士苏黎世大学的Gerald Schwank实验室与荷兰玛西玛公主小儿肿瘤中心的Sean C. Semple实验室合作，在Nature Biotechnology杂志发表In vivo adenine base editing of PCSK9 in macaques reduces LDL cholesterol levels的文章，该研究的策略与Nature文章类似，借助于脂质纳米颗粒递送的ABE系统，研究者在小鼠和非人灵长类动物中成功实现了肝脏组织中PCSK9基因的精准编辑，最终有效降低了血液中PCSK9和LDL蛋白的含量，这为未来肝脏疾病治疗提供了新思路。

总体而言，两项研究均表明，利用脂质纳米颗粒LNPs递送单碱基编辑工具ABE可实现非人灵长类动物肝脏中PCSK9基因的高效精准编辑，而且只需单次注射便可实现血液中PCSK9和LDL胆固醇的持久降低，这为心血管疾病的预防和治疗提供了全新的思路。这是研究者首次在非人灵长类动物体内开展单碱基编辑治疗的研究，具有非常重要的指导意义，将极大的推动单碱基编辑技术的临床转化应用。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-021-03534-y

参考文献

1. R Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without
DNA cleavage. Nature 551, 464–471 (2017).

2. Koblan, L. W. et al. In vivo base editing rescues Hutchinson–Gilford progeria syndrome in mice. Nature 589, 608–614 (2021).

3. Petri, K. et al. Global-scale CRISPR gene editor specificity profiling by ONE-seq identifies population-specific, variant off-target effects. Preprint at https://doi.org/10.1101/2021.04.05. 438458 (2021).