负载PRP的水凝胶支架用于骨软骨修复

由多种原因（创伤、过度负荷、老化和炎症）造成的骨软骨缺损是目前常见的临床疾病，软骨由于其特殊的生理结构（软骨内细胞数量少、缺乏血管、神经和淋巴管）导致损伤后自我修复能力有限。尽管微骨折(Micro-fracture，MF)手术，自体软骨细胞植入(Autologous Chondrocyte Implantation, ACI)术及自体或异体软骨组织移植术也在临床上取得了一定的成果，但其长期预后仍然存在较多的不确定性及潜在风险。

目前，组织工程学已成为骨软骨缺损后修复的潜在选择之一。生物可降解支架、组织形成细胞和生长因子是其的三大主要组成部分。近年来，富血小板血浆（PRP）作为一种自体源性的生物活性制剂，在临床上被广泛用于皮肤创面修复，肌肉肌腱愈合，骨软骨再生等领域。然而，PRP由于其独特的生物特点（血小板激活后生长因子瀑布式释放）无法在体内长期稳定存在，因而其长期治疗效果欠佳。GelMA作为一种生物学性能优异的光固化明胶基水凝胶，可否用于包裹PRP，提升PRP的长期疗效呢？

近期，浙大二院严世贵教授、颜瑞建医师团队与EFL团队合作，构建PRP-GelMA水凝胶复合支架，并用于骨软骨损伤修复。通过长达18周的动物体内实验发现，该复合支架能够在长时间内（18周）有效促进骨软骨修复，并调节修复部位周围免疫细胞向有利于组织修复的亚型极化。相关工作以“A 3D-printed PRP-GelMA hydrogel promotes osteochondral regeneration through M2 macrophage polarization in a rabbit model”发表于Acta Biomaterialia，浙大医学院姜广曜博士生、李思浩博士生、浙大机械工程学院喻康博士生为共同第一作者，严世贵教授、贺永教授、颜瑞建医师为共同通讯作者。

实验流程示意图

体外实验中在不同浓度PRP-GelMA水凝胶表面进行兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养，通过划痕实验，Transwell实验等观察其迁移，增殖等情况。

图1 BMSCs在不同浓度（0,10%，20%，50%）PRP-GelMA水凝胶表面的迁移增殖情况

在不同浓度PRP-GelMA水凝胶表面进行兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养，并通过PCR及细胞染色观察其成骨及成软骨分化情况。

图2 BMSCs在不同浓度（0,10%，20%，50%）PRP-GelMA水凝胶表面的成骨及成软骨的情况

通过上述体外实验我们发现，20%PRP-GelMA相较于其他浓度水凝胶复合体兼具较好的细胞增殖迁移及分化性能，因此，我们选择20%PRP-GelMA作为后续实验浓度。

通过LPS激活的小鼠巨噬细胞（M0）在20%PRP-GelMA水凝胶表面培养后，其M2型巨噬细胞相关基因及蛋白升高，M1型巨噬细胞相关基因及蛋白降低。

图3-4 通过LPS激活的小鼠巨噬细胞在PRP-GelMA水凝胶表面的极化特性的改变

随后，研究人员通过投影式光固化3D打印PRP-GelMA水凝胶支架并对其性能进行分析。

图5 基于投影式光固化技术的PRP-GelMA水凝胶支架各项表征及力学特性

将PRP-GelMA水凝胶支架应用于兔骨软骨缺损模型中，在不同修复时间点，通过大体样本观察及Micro-CT扫描及三维重建评估不同组间修复效果。结果显示无论是ICRS评分还是BV与TV比值，PRP-GelMA支架治疗组均在第18周时出现显著差异。

图6 兔骨软骨缺损大体样本及Micro-CT扫描结果及分析

随后，研究者通过H&E，番红固绿染色和偏正光扫描技术观察骨软骨修复过程中组织学改变情况。组织学结果显示PRP-GelMA组在不同时间点内均有较好的修复效果。

图7 骨软骨组织学及偏振光扫描结果及分析

最后，研究者在组织切片中对M2型相关蛋白（Arg1，CD163）及M1型巨噬细胞相关蛋白（CCR7）进行免疫组化染色并分析。结果显示CCR7在PRP-GelMA支架治疗组中持续下降，而代表早期M2型的Arg1则在第6周时显著升高，而CD163则在第6及第12周时显著升高。根据该结果我们合理推测，随着修复过程的进行，PRP-GelMA支架治疗组中，M1型巨噬细胞含量逐渐下降，而M2型巨噬细胞则由早期的M2a型向M2c型转化。

图8-9 骨软骨组织免疫组化染色结果及分析

结合上述研究结果，我们推测，PRP-GelMA支架在骨软骨修复过程中不仅直接促进了干细胞的迁移增殖及分化，并调控组织免疫细胞（巨噬细胞），共同促进组织修复，并在较长的时间内达到稳定的治疗效果。该研究为未来骨软骨缺损修复提供了新的思路。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.actbio.2021.04.010