不拘小节的肌小节：最接近于真实状态下肌小节中蛋白质的分布

撰文｜王浙鑫

肌肉是人体最重要的组织之一，其中骨骼肌的正常工作保证了我们能够有效而又准确的运动。骨骼肌细胞由许多的肌原纤维（myofibril）组成，每条肌原纤维又是由多段肌小节 (sarcomere) 连接而成。在肌小节内，肌球蛋白(myosin) 组成的粗肌丝 (thick filament) 和肌动蛋白 (actin) 组成的细肌丝(thin filament) 相互作用，产生肌肉的收缩和放松。

图1. 骨骼肌的层次结构。(Squire, 2016【1】)

一直以来，人们都在不断通过对肌小节的结构研究来提升对肌肉工作机制的理解。从三百多年前列文虎克（Antonie van Leeuwenhoek）第一次在显微镜下观测到肌小节以来，关于肌小节结构的研究也随着显微镜尤其是电子显微镜技术的发展而不断深入。

1954年，两篇关键性的文章【2,3】通过观测肌小节的结构提出了解释肌肉收缩的肌丝滑动理论[注1]。随后的几十年间，研究人员获得了不同种类的肌小节的二维图像，也有一些研究人员采用断层扫描（tomography）的方法重构了肌小节的三维图像。然而因为技术的限制，肌肉样品通常要经过化学固定、染色、机械切割等许多会产生人为假象的步骤，这导致了不仅获得的图像分辨率有限，而且样品通常局限在十分规律的肌肉中（例如昆虫的肌肉）。

因此近些年来，对肌肉相关结构的研究大多运用了一种分而治之的策略：既然获得整体的肌小节结构存在诸多困难， 那么研究人员就采用先进的结构生物学手段（例如X光结晶衍射（X-ray crystallography）和单颗粒冷冻电子显微镜(single particle cryo-EM)）获得单个的高分辨率的蛋白质或者蛋白质复合体的结构。他们通过这些单独的结构来推测他们在肌小节中的相互作用。但是蛋白质在不同环境下所展现的形态是不同的，要想真正的理解肌肉的构成、在收缩放松的时候的状态、以及各种肌肉疾病的机理和诱因，对一个完整的肌小节的结构研究仍必不可少。

2021年3月24日，德国马克斯普朗克分子生理学研究所的Stefan Raunser团队 （共同第一作者为王浙鑫、Michael Grange）与英国国王大学学院的Mathias Gautel团队在Cell杂志上线了题为The molecular basis for sarcomere organization in vertebrate skeletal muscle的文章。研究人员利用最新的冷冻聚焦离子束切割（cryo focused-ion-beam milling）技术和电子冷冻断层扫描（electron cryo-tomography）技术第一次揭示了骨骼和心肌细胞基本收缩单位——肌小节的高分辨率三维图像。

作者首先用急速冷冻（plunge freezing）的方法在极低的温度下（约-175°C）将提取自小鼠的肌原纤维保持在接近原生的状态。随后用聚焦离子束将肌原纤维切成约100纳米厚的薄片。运用电子冷冻断层扫描[注2]的方法，不需要任何染色，作者直接观测到了完整的肌小节的三维结构。

整个流程对肌肉样品的破坏非常小，最大程度的保持了蛋白质的水合状态和原生性。在电子显微镜下，肌小节的各个区域例如M带 (M-band)、A带 (A-band)、I带 (I-band) 、Z线 (Z-disc) 可以很清晰的分辨出来。在更高的放大倍数下，研究人员可以在三维空间内追踪每一条肌丝，甚至可以看到整个肌小节中单个蛋白质亚基的精细结构。

图2. 透射显微镜下的肌小节亚结构以及示意图

作者首先分析了在A带中的横桥（crossbridge），横桥是粗细肌丝的横向连接，由肌球蛋白的头部 (head domain) 组成，也是肌丝滑行的“马达”。得益于极高的分辨率，每一个肌球蛋白的头部都可以直接被观测到。通过分析这些横桥的分布，作者发现总体来看横桥每37纳米会出现，但具体的结合位点和横桥数量上却是随机的，说明了肌肉中肌球蛋白和肌动蛋白的结合仅仅是受他们位置和朝向的限制，并没有其他因素去调节。同时，作者还发现肌球蛋白的两个头部可以分开而结合到两条不同的细肌丝上。作者然后采用了亚断层图平均 (sub-tomogram averaging) 的方法第一次解析了一个完整的双头肌球蛋白结合在细肌丝上的结构。这个分辨率大约在1纳米的结构揭示了在原位中肌球蛋白，肌动蛋白和伴肌动蛋白（tropomyosin）的结合细节。同时，这个双头的肌球蛋白结构展示了一种新奇的构型，两个头部在轻链(light chain)部分的弯曲是完全相反的，第一次解释了肌球蛋白的两个头部是如何同时工作而又能产生相同的扭矩和步幅。

图3. A带的细肌丝与肌球蛋白复合体结构

接下来作者把目光转向了I带，I带是连接A带与Z线的区域。长久以来，科学家从肌小节的横截面发现了肌丝在A带呈六边形分布，而在Z线成四边形分布，却不知道两种分布是如何过渡的。作者通过追踪I带的每一条肌丝，证实了这种过渡并没有固定规律。通过亚断层图平均，作者又解析了I带中的细肌丝结构。有趣的是，在I带中的伴肌动蛋白与在A带中的伴肌动蛋白呈现了不同的位置。虽然科学家在离体实验中已经知道伴肌动蛋白根据是否结合肌球蛋白和钙离子浓度的不同会改变状态，但是这个原位结构上的不同告诉我们伴肌动蛋白的调节作用在一个肌小节中不是总体的，而是局部的。

图4. I带的细肌丝结构

最后，作者分析了Z线区域的结构。不同于以前从二维图像中获得的信息，作者发现了Z线的厚度是可以变化的，就像是一个平行铰链，这些不同的构型或许是与肌小节中的拉力有关。通过对Z线区域细肌丝和横向连接（也就是α- 辅肌动蛋白（α-actinin））的分析，作者得到了一张Z线区域的三维分子模型。与以往的认知不同，这个模型展示了不规律的α- 辅肌动蛋白网络。同时，作者还发现了相隔约6纳米成对出现的α- 辅肌动蛋白，说明他们可以结合相邻的两个肌动蛋白亚基。

图5. Z线区域的组织结构

综上所述，这项研究是科学家首次在分子层面直观的探索肌小节的三维结构，研究人员观测到了最接近于真实状态下肌小节中的蛋白质的分布，揭示了一系列肌丝相关的蛋白质的分子细节，也颠覆了多数人认为肌小节中结构就像几何一样规律的认知，展示了哺乳动物肌肉的结构的灵活性。这些看似“不拘小节”的不规律结合帮助了哺乳动物的肌肉应对各种各样的外力。更重要的是，这项研究只是一个开始，相似的方法可以很容易的扩展到不同状态下甚至患病的肌肉样品上。由于小鼠的肌肉与人类的肌肉非常相似，接下来研究人员计划研究来自活检或来自多能干细胞的肌肉组织，很快人们就能在分子甚至原子水平上研究肌肉的疾病和衰老，为未来治疗肌肉疾病铺好了地基。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.02.047

参考文献

1. Squire JM. (2016) Muscle contraction: Sliding filament history, sarcomere dynamics and the two Huxleys, Global Cardiology Science and Practice 2016:11

2. Huxley, H., and Hanson, J. (1954). Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their structural interpretation. Nature 173, 973–976.

3. Huxley, A.F., and Niedergerke, R. (1954). Structural changes in muscle during contraction; interference microscopy of living muscle fibres. Nature 173, 971–973.