撰文 | nagashi
CRISPR技术的兴起使人类能够以自己的意志去改变基因的表达模式，不仅如此，越来越多的CRISPR基因编辑工具正在涌现，目前CRISPR技术不仅在基因编辑领域大显身手，还在核酸定位、核酸检测等领域也展现出良好的应用前景。
然而，作为一种已经广泛使用的基因编辑工具，CIRSPR技术目前仍难以实现高时空分辨率的精准控制。但技术是不断革新的，科学家们也在不断改进CRISPR技术，使其功能愈发强大。
近日，美国伊利诺伊大学芝加哥分校的研究人员在Molecular Cell杂志上发表了题为：Sequential Activation of Guide RNAs to Enable Successive CRISPR-Cas9 Activities 的研究论文【1】。
这项研究开发了一种新的基因编辑技术，可以随着时间的推移对靶点序列进行剪切，从而实现多个基因操作能够作为预编程事件进行级联执行。
此前，我们曾报道北京大学药学院汤新景团队在Angewandte Chemie杂志发表的研究论文【2】。利用光敏crRNA对CRISPR/Cas9基因编辑系统进行光学控制，从而实现在特定的时候激活CRISPR/Cas9系统的活性对靶点进行编辑。这项研究即是对CRISPR基因编辑高时空分辨率调控的探索。详情：北大汤新景团队开发新型光敏crRNA，实现对Cas9高时空分辨率调控，降低脱靶效应
究其根源，CRISPR-Cas系统是一种广泛存在于原核及古核生物的免疫系统，CRISPR-Cas系统可以摄取外源DNA片段，并将其插入到自身的间隔序列中，间隔序列转录出的向导RNA(gRNA)引导Cas蛋白特异性切割与之互补的DNA序列。
但值得注意的是，目前基于CRISPR的基因编辑系统大多都有一个共同的缺点，即所有的编辑或剪切都是一次完成的。这也意味着，我们无法有效控制编辑的发生时间及其发生顺序。
因此，本研究的领导者Bradley Merrill及其研究团队致力于开发一个开放的CRISPR-Cas系统，以提供多路复用并且在时间顺序上可编程。
在这项研究中，研究团队设计了一种特殊的gRNA分子——“proGuides”，这种gRNA分子的编码序列中插入了一个顺式切割的核酶序列，导致gRNA在转录时会发生切割，这些proGuides因此可以保持在非活动状态，其靶向的DNA序列也不会被编辑。
研究人员通过另一种不同的gRNA引导spCas9删除核酶序列，将proGuides转化为一种成熟的gRNA活性形式，然后活化的gRNA引导spCas9编辑新的基因位点，与此同时，它还会活化下一种proGuides，由此形成一个gRNA级联链。
级联激活的sgRNA实现时间顺序可编程的CRISPR基因编辑
简单而言，这个新的CRISPR-Cas系统的创新模块由许多相互级联的gRNA组成——一种gRNA可以激活另一种gRNA。并且，这一模块还可以设计成按特定顺序排列的遗传算法程序，从而实现基因编辑的时间顺序可编程。
不仅如此，研究团队还成功利用该系统实现了链式排列的四个顺序步骤的基因编辑功能，以及由两个分支点组成的分支级联，并诱导细胞中两个顺序的基因组编码表型变化。
多种proGuides介导顺序级联的spCas9活性
对此，通讯作者Bradley Merrill表示：“时间因素是系统发育和疾病进展的关键因素，但目前研究这些过程的遗传学方法在时间因素上并不有效。我们的系统允许以预先编程的方式进行基因编辑，使研究人员能够更好地研究时间敏感的过程，比如癌症是如何从一些基因突变发展而来的，以及这些突变发生的顺序如何影响疾病。”
本研究的模式图
总而言之，该研究开发了一种全新的CRISPR-Cas系统，该系统可以实现对多个基因位点的、随时间顺序的级联基因编程。该系统的进一步发展将使哺乳动物中复杂的细胞生物学过程的长期遗传记录和编程成为可能！
参考资料：
1、https://doi.org/10.1002/anie.202009890
2、https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.12.003
3、https://www.sciencedaily.com/releases/2021/02/210223150847.htm
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