府伟灵教授：MicroRNAs与外泌体检测新技术

microRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码小分子RNA，研究表明miRNA与肿瘤形成有着密切的联系；外泌体是具有脂质双层膜结构的纳米级微小囊泡，在肿瘤发生发展中发挥着重要的作用。

今天，检验君为大家带来的是陆军军医大学西南医院检验科府伟灵教授在2020-2021年度关于microRNAs与外泌体检测方法的最新研究报道。

新型太赫兹超材料生物传感器可有效检测MicroRNAs

近年来，越来越多的研究开始聚焦于太赫兹（THz）光谱在核酸构象和功能研究中的应用，但其检测灵敏度低限制了其潜在生物传感应用。解决检测灵敏度的问题，很多问题将迎刃而解。

近日，陆军医科大学西南医院府伟灵教授研究团队开发了一种新型太赫兹生物传感器，具有高灵敏度的miRNA检测能力，在核酸分析和肿瘤诊断中具有重要的应用前景。该研究发表在《Biosensors and Bioelectronics》。

该传感器检测过程：首先将miRNA-21与模板DNA杂交，并使用Klenow片段聚合酶使DNA链延伸，在形成完整双链DNA后用缺口内切酶切割延伸的DNA链，Klenow片段随后启动新一轮复制，第一个复制的DNA链被置换和释放。多次重复，大量的触发DNA随之产生。

随后用巯基探针修饰纳米颗粒，形成纳米探针，将纳米探针和生物素探针与其触发DNA链的互补片段杂交，形成生物素化纳米颗粒-触发DNA复合物。生物素化的复合物通过与链霉亲和素包被的磁珠结合后被捕获。经过磁分离和脱杂化后，分离出纯纳米颗粒触发DNA复合物，最后将其滴注在超材料表面进行THz测量。

研究小组从实验和理论上研究了纳米颗粒直径和金属类型对超材料共振的影响。在最佳条件下，THz超材料生物传感器具有良好的检测灵敏度，检测限为14.54aM，对miRNA-21在1fM-10pM浓度范围内呈线性响应。通过测定加标血清中miRNA-21的含量，标本回收率在90.92%～107.01%之间。

该研究应用链置换扩增技术和金属纳米粒子的信号增强，制备了一种偏振无关的THz超材料生物传感器，而且研究结果表明，该生物传感器具有高灵敏度的miRNA检测能力，在核酸分析和肿瘤诊断中具有重要的应用前景。

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0956566320308599?via%3Dihub

血液MicroRNA即时检测定量平台

MiRNA-150是一种非小细胞肺癌（NSCLC）中异常表达的基因调节剂，监测血清中循环的miRNA-150可以为诊断早期NSCLC提供可靠的临床检测方法，因此，研发出敏感而特异的microRNAs检测方法意义重大。

日前，陆军医科大学西南医院府伟灵教授研究团队在不涉及任何其他复杂扩增技术的情况下，开发了一种快速、特异且敏感的变构球形纳米探针，用于miRNA-150的测定，可以快速精准的区分NSCLC患者和健康人群血清中miRNA-150表达。该研究发表在《Journal of Nanobiotechnology》。

与传统的发夹探针相比，变构球形纳米探针具有更大的富集能力和反应截面。结构上，它由磁性纳米颗粒和双发夹组成。在没有miRNA-150的情况下，球形纳米探针通过DNA自组装形成发夹结构，可以促进附近荧光团（FAM）和猝灭剂（BHQ1）的Förster共振能量转移（通过供体-受体之间长程偶极-偶极作用的一种非辐射能量转移过程），引发荧光淬灭。

在靶标存在的情况下，靶标探针杂交可以打开发夹，形成活跃的Y结构，将荧光团和猝灭剂分离，产生荧光信号。然后，在多点荧光扫描芯片上记录荧光结果。荧光读出方式不同于传统的荧光扫描仪，微阵列装置更为便携、紧凑，尤其适用于POCT应用。

这样一来，miRNA-150的检测是通过变构球形纳米探针与靶结合后的荧光变化来确定。由于其固有的荧光信号转导机制，双发夹球形结构具有较高的信号背景比，是一种灵敏的探针，线性范围为100fM～10nM，检测限为38fM。

该探针能够将特定的miRNA-150识别反应转化为可测量的荧光信号，表现出很高的灵敏度和广阔的检测范围，双环茎结构可以识别单碱基不匹配的靶标。

研究人员表示，该探针为肺癌的临床诊断提供了新方法，同时希望这种变构球形纳米探针可以早日用于生物分析，尤其是在POCT领域。

文章链接：

https://jnanobiotechnology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12951-020-00717-z

适配体-胆固醇介导的邻近连接法可准确鉴定外泌体

外泌体可运输多种功能性物质，在促进细胞通讯中起着不可或缺的作用。此外，外泌体的准确鉴定在促进疾病诊断和治疗中也起着至关重要的作用。

日前，陆军医科大学西南医院府伟灵教授、重庆大学医学院罗阳教授提出了一种适配体-胆固醇介导的邻近连接测定法（AcmPLA），用于在双探针策略中精确鉴定外泌体。该研究发表在《Analytical Chemistry》。

研究人员利用适配体探针识别外泌体固有表面蛋白CD63，再利用胆固醇探针进行生物脂质层靶向，通过将外泌体生物标记物结合的探针近距离连接，进行特异识别和滚环扩增（RCA）信号放大，成功开发了一种外泌体检测方法，可以对双重生物标记物进行“和”逻辑分析，该方法不仅可以用于外泌体的定量分析，而且可以用于外泌体的示踪。除了RCA引发的信号扩增外，还利用CD9抗体标记的磁珠捕获外泌体，用于分离和二次信号富集。

利用AcmPLA策略对外泌体的鉴定具有较高的特异度和灵敏度。首先，同时识别脂质双层和膜表面蛋白CD63，大大降低了游离外泌体表面蛋白的干扰风险；其次，近距离连接和RCA简化创造了良好的灵敏度；最后，抗CD9抗体标记磁珠（anti-CD9MBs）进一步保证了分离外泌体的纯度，保证了最终准确性。

该研究提出了一种基于适配体-胆固醇双重介导的近距离连接反应的外泌体鉴定策略，通过较高的特异度和灵敏度检测，可实现对外泌体的原位成像和量化鉴定。该研究方法可以作为一个通用的平台，用于检测具有类似细胞膜结构的靶标，并且能为生物分析提供一个全新的途径，有助于诊断各种疾病，特别是恶性肿瘤。

研究人员表示，该方法可以实现特异性外泌体的分离和准确鉴定，有望在生物科学、生物医学工程中得到广泛的应用。

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.0c00141

使用CRISPR/ Cas12a快速检测外泌体

大量研究表明，外泌体与各种疾病，尤其是癌症的发病机理密切相关。因此，一种快速、灵敏的外泌体检测方法对疾病的诊断和预后至关重要。

日前，陆军医科大学西南医院府伟灵教授、重庆大学医学院罗阳教授提出了一种基于CD63适配体和簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas12a系统的外泌体检测方法，该方法具有高灵敏度和特异度，为外泌体相关疾病的诊断提供了新途径。该研究发表在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》。

该研究报道了一种基于CD63适配体和CRISPR/Cas12a反式切割的快速、灵敏的外泌体检测技术。在该设计中，CD63适配体被互补DNA链（阻断剂）部分阻断，用于捕获携带CD63的外泌体。

外泌体与CD63适配体的结合触发了CD63适配体构象变化，从而释放阻断剂，阻断剂可以被CRISPR/Cas12a识别，并触发对单链DNA探针的反式切割。将两端标记有荧光色素（Cy3）和相应猝灭基团（黑洞猝灭剂）的探针切断，从而产生荧光信号，该荧光信号与磁珠捕获的外泌体正相关。

该方法主要包括基于CD63适配体的胞外体膜蛋白识别和基于CRISPR/Cas12a的信号放大，CD63适配体作为一种易于适应的核酸链，负责将胞外体的数量转化为核酸检测，而CRISPR/Cas12a负责高度特异的核酸信号放大，检测范围为每微升3×103～6×107粒。

为了进一步验证该方法，研究人员采集了肺癌患者和健康人的血样标本，使用该方法和纳米粒子跟踪分析技术分别检测其中外泌体。结果显示，两种检测结果高度一致，进一步验证了该方法的准确性。

文章链接：

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00216-019-02211-4

第90期前沿报道到此结束