南极磷虾肽促进小鼠骨折愈合作用及其机制

骨折是由外力作用、骨骼疾病等引起的骨或骨小梁的连续性中断，容易造成骨折延迟愈合或不愈合的现象。有统计数据显示，长骨开放性骨折后，17%的患者出现骨不连现象，另有8%患者的骨骼出现延迟愈合，严重影响患者健康及日常生活。骨折延迟愈合引起的高致残率与I型糖尿病、中风或获得性免疫缺陷征对患者产生的影响相当。目前还没有被批准的药物用于加速骨折愈合或治疗骨不连。临床上常采用物理和基因治疗的方法治疗骨折，但是这些方法价格昂贵，也有可能出现副作用，所以人们期望采取膳食治疗的方法辅助临床治疗，加快患者骨折愈合速度；因此，通过膳食治疗来加快骨折愈合逐渐成为研究热点。

有文献表明南极磷虾肽（AKP）具有抗疲劳、抗氧化、降血压等活性，本课题组前期研究发现，经酶解产生的低氟AKP和磷酸化磷虾肽可以有效调节去卵巢大鼠体内的骨稳态，且能通过激活BMP2/Smads和Wnt/β-catenin分子途径促进骨形成，改善老年性骨质疏松症，而骨形成对桥接愈伤组织的稳定性至关重要，但有关AKP调节骨折愈合及其机制的研究尚鲜见报道。中国海洋大学食品科学与工程学院的李 卓、王静凤*和青岛海洋生物医药研究院的田迎樱等人以AKP为研究对象，研究其对小鼠骨折愈合过程的促进作用及相关机制，以期为南极磷虾蛋白的高值化利用提供理论依据。

1、AKP对软骨性骨痂形成的影响

如图1所示，骨折术后5 d，模型组骨折断裂端间隙大，只有少许炎性细胞及未分化的间充质细胞，断裂处尚未形成纤维骨痂。与模型组相比，灌胃AKP后，低剂量组骨折断裂处的炎性细胞及间充质细胞数量明显增多，有利于纤维骨痂的形成；高剂量组能够更快地度过炎症期，血肿更快演变成纤维结缔组织，使两个断裂端初步连接在一起，并已出现少许成熟的软骨细胞，有利于软骨性骨痂的形成，且效果明显优于低剂量组。

2、AKP对软骨性骨痂向骨性骨痂转变的影响

如图2所示，骨折术后10 d，各组均处在软骨痂期。模型组的软骨细胞大多为未成熟且排列紧密的幼稚软骨细胞，尚未出现成熟肥大、矿化的软骨细胞。灌胃AKP后，低剂量组骨折周围软骨细胞多为成熟的肥大软骨细胞，且出现少量矿化新骨；高剂量组软骨细胞面积明显减少，且有大量骨小梁及新生血管出现，矿化凋亡更明显。本实验发现，AKP的干预以剂量依赖性的方式促进软骨性骨痂向骨性骨痂转变，在术后中期（10 d）能不同程度地促进软骨细胞的肥大矿化和骨折愈合。

3、AKP对板层骨的形成及硬骨痂重塑的影响

骨折术后21 d，各组均处在硬骨痂期，此时模型组的骨痂为松散的编织骨，排列不规则，骨细胞数量多、体积大、不成熟（图3A1）；灌胃AKP后，低剂量组编织骨面积明显增加，形成了更密集的骨组织（图3A2）；高剂量组的骨细胞趋于成熟，体积小、数量少，能形成更致密、更厚实的骨组织，并已经向板层骨转化（图3A3），AKP的干预可以在骨折后期（21 d）促进新骨生成并由编织骨向板层骨转化。

为进一步观察硬骨痂骨量和微结构的变化，对骨折术后21 d的骨痂进行了三维扫描。结果如图3B所示，模型组愈合缓慢，小梁骨骨质稀疏，且皮质骨尚未形成完整的结构。低、高剂量组骨痂形态更好，皮质骨更光滑。相比于模型组，低剂量组的骨体积/组织体积和骨小梁数分别极显著增加了12.54%和18.00%（P＜0.01），骨小梁间距显著减少了14.29%（P＜0.05）；高剂量组的骨体积/组织体积和骨小梁数分别极显著增加了45.44%和22.10%（P＜0.01），骨小梁间距极显著减少了17.31%（P＜0.01），高剂量AKP干预生成的骨体积/组织体积更大，骨小梁间距更低（图3C），即AKP干预可显著促进骨痂重塑（P＜0.05）。

4、AKP对骨折愈合血清指标的影响

骨折术后第10天，与模型组相比，AKP干预显著降低了血清Aggrecan质量浓度（P＜0.05），低、高剂量组分别降低了15.68%、16.22%（图5A）；血清TGF-β的质量浓度极显著升高（P＜0.01），低、高剂量组分别升高了5.69%、10.45%（图5B）。说明AKP的干预有促进软骨基质合成、软骨细胞分化成熟的作用，使其提前度过软骨基质合成高峰期，向软骨细胞成熟与矿化迈进。

VEGF是血管生成诱导因子，Col1α是新骨生成的标志。各组VEGF质量浓度均在术后第10天达到最高水平；术后第21天，高剂量组血清VEGF质量浓度较模型组极显著降低了21.45%（P＜0.01）（图5C），同时高剂量组中Col1α质量浓度较模型组极显著增加了15.5%（P＜0.01）（图5D），表明AKP在愈合中后期较模型组可更早地进行血管重建从而促新骨生成，且高剂量AKP效果优于低剂量AKP。

5、AKP对软骨内成骨过程关键基因转录的影响

由图6可知，与模型组相比，骨折术后第5天，高剂量组SOX9的mRNA相对表达水平极显著提高了94.34%（P＜0.01）；骨折术后第10天，低、高剂量组SOX9的mRNA相对表达水平分别显著提高了28.73%、142.62%（P＜0.05，P＜0.01），Col10α相对表达水平分别极显著提高了84.37%、146.8%（P＜0.01）；骨折术后第21天，低、高剂量组SOX9的mRNA相对表达水平分别显著降低了23.15%、45.37%（P＜0.05，P＜0.01），Col10α相对表达水平分别极显著降低了83.3%、88.5%（P＜0.01）， 具有剂量依赖效应。说明低、高剂量组的软骨形成进程均不同程度地领先于模型组，显著加快了软骨细胞的肥大和成熟，从而加快软骨内成骨进程。

由图7可知，模型组MMP13、VEGF mRNA转录水平均在骨折术后第21天达到高峰，提示模型组基质降解及血管生成速率较慢，骨折愈合进程滞后。而经AKP的干预在第10天可提高MMP13、Ang1、VEGF mRNA转录水平，其中高剂量组效果更显著，较模型组分别极显著提高了57.71%、34.69%和57.46%（P＜0.01），而在第21天MMP13、Ang1、VEGF mRNA转录水平显著下调。说明AKP干预后较模型组显著加快了软骨基质的降解及新血管的生成，从而加速软骨内骨化进程。

由图8可知，骨折术后第10天，AKP的干预可以提高TGF-β、Col1α和OCN mRNA的转录水平，且总体上高剂量组效果优于低剂量组。提示模型组新骨生成进程滞后，而AKP的摄入可以剂量依赖性地加快新骨生成速率，促进骨折愈合。

讨 论

综上，AKP能通过促进软骨形成及其肥大、促进软骨基质降解、血管入侵以及后期新骨生成来促进软骨内成骨进程，从而加速正常生长的开放性骨折模型小鼠的骨折愈合。

本文《南极磷虾肽促进小鼠骨折愈合作用及其机制》来源于《食品科学》2020年41卷21期99-105页，作者：李卓，田迎樱，李雪静，于朋，王静凤。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190916-192。

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修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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