Cell | LiP-MS技术原位监测蛋白结构变化与分子事件发生的相关性

撰文 | Qi

责编 | 兮

基于定量质谱的蛋白质组学方法已经能够确定细胞扰动和疾病发展过程中参与调节的途径，并能够揭示药物作用和耐药性机制【1】。然而，许多导致蛋白质功能改变的分子事件并不涉及蛋白质丰度的变化，譬如翻译后修饰（PTM）、裂解或环境变化引起的构象变化等【2,3】。蛋白质组学工作流程的“变体”，如磷酸蛋白质组学、互作组学（interactomics）和基于活性的蛋白质组学等可以捕获影响蛋白质功能的特定分子事件，但通常仅能报告单一类型的机制，在蛋白质组大范围内对不同的调控事件进行高通量同时分析是不可行的【4-6】。

至少到目前为止，人们坚信“蛋白质的结构与其功能密切相关”，那么是否可以推断“对蛋白质结构的整体分析将能够作为一个定量读数以捕获大多数蛋白质功能状态改变的事件”？蛋白质结构整合了导致功能改变的不同类型的分子线索，包括与其他分子的结合、蛋白质间相互作用、PTMs、突变、聚集以及由于细胞基质变化而引起的构象改变等，所有这些都会导致蛋白质的局部或整体结构改变。因此，通过在蛋白质组大范围内测量蛋白质结构状态的改变，可以同时检测各种类型的蛋白质功能变化，得到比仅测量丰度变化更为详尽的数据。

2020年12月22日，来自瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组在Cell杂志上发表了一篇题为Dynamic 3D proteomes reveal protein functional alterations at high resolution in situ的文章，该课题组利用先前自行开发的能够监测蛋白质结构变化、并识别不同条件下结构特异性蛋白水解指纹图谱的限制性蛋白水解-质谱（limited proteolysis-mass spectrometry, LiP-MS）技术，在经历营养适应的细菌和对急性应激刺激作出反应的酵母中通过结构读数捕捉到酶活性变化、酶底物位置占有率、变构调节、磷酸化和蛋白质与蛋白质的相互作用，精确定位单个功能位点。此外，这项工作验证了大肠杆菌糖磷酸转移酶与代谢物果糖-1,6-二磷酸（FBP）之间的相互作用，提出先前未表征的葡萄糖摄取调节系统。总的来说，这种结构方法在原位报告了许多功能事件，并通过强大读数来检测潜在的生理和病理表型背后的分子事件。

首先，作者对指数生长的酵母培养物施加短期的渗透或热应激，提取蛋白质组后应用LiP-MS工作流程，同时监测蛋白质丰度和结构变化。通过独立数据采集、无标记定量分析得到的肽混合物，对蛋白质丰度变化数据进行校正，以获得每种可检测蛋白质的结构特异性蛋白水解指纹图谱。为了验证结构读数是否能够准确捕获已知生物过程的激活，作者对结构改变的蛋白质进行了功能富集分析，与先前研究一致，例如发现了与翻译调控和蛋白质折叠、错误折叠和复性相关功能途径富集于热应激数据集。

图1. 本研究使用的实验系统以及酵母和大肠杆菌中细胞反应过程中的总体蛋白质结构和丰度变化

由于在渗透应激反应期间MAPK通路中发生若干磷酸化事件，作者将LiP-MS读数与平行的磷酸化蛋白质组学分析进行比较，证实结构和磷酸蛋白质组学分析关系互补，且根据磷酸蛋白质组学数据和已知的激酶/底物关系，作者确定了12种激酶或磷酸酶在渗透应激条件下的活性发生明显变化。此外，作者还检测到其中11种酶的14种已知靶蛋白的结构变化和磷酸化改变，因此，这些结构变化可以通过特定激酶和磷酸酶的上游活性改变来解释。值得注意的是，磷酸化蛋白质组学分析仅限于蛋白质分子的磷酸化部分，而LiP-MS则监测磷酸化和非磷酸化蛋白池的平均结构状态，如果磷酸化水平较低，则LiP-MS可能检测不到差异磷酸化蛋白区域的结构变化。

类似地，基于先前一项报道177种酵母提取物蛋白质在热激时形成某种“聚集物”的研究，作者探讨了LiP-MS报告蛋白质间相互作用的能力。在这项工作中，作者发现酵母热激后结构改变的蛋白质明显富集于聚集物，其中177个有96个显示出结构变化，而只有4个显示出蛋白丰度变化。随后，使用超速离心实验以及添加蛋白酶来确定LiP-MS是否能在热激时检测到聚集，或者聚集之前的结构变化。最终结果显示，结构读数能够捕捉到热激酵母中的蛋白质聚集等的变构调节现象。

接下来对于第二个系统，作者研究了在八种碳源中生长的大肠杆菌，同时利用最近的一项分析，即通过大肠杆菌中心碳代谢（central carbon metabolism, CCM）的代谢物水平和代谢流量在相同生长条件下表现出条件依赖性，作者推断流量变化可以作为酶功能状态改变的“代理”，并用它来评估结构读数的能力，以报告CCM的功能变化。与葡萄糖相比，每种生长条件下蛋白质结构和丰度的差异分析表明，平均共有365种蛋白质发生结构改变，并且有190种蛋白质发生了丰度变化，正如在酵母实验中所观察到的，与丰度变化相比，更多的蛋白质发生了结构变化。

类似地，作者也对不同碳源中结构和丰度变化的蛋白质进行功能富集分析。结果显示，在改变丰度的蛋白质中不存在糖酵解途径的富集，这与先前的观察一致，即糖酵解不主要在转录水平受到调控，与此相反，在所有生长条件下发生结构改变的蛋白质中均存在糖酵解途径的富集。诸如此类的结果提示，不同的调控机制控制着生长在不同碳源上的大肠杆菌CCM的不同分支，糖酵解受影响蛋白质结构而非基因表达的调控机制控制，而TCA和乙醛酸循环除了影响蛋白质结构的调控过程外，还受到蛋白丰度的影响。

此外，作者推断检测到的CCM酶的结构变化可能是变构调节的基础，那么在这些情况下，代谢物调节子的水平应该与靶酶变构位点的结构改变相关。为此，作者使用线性回归测试八种生长条件下CCM酶的结构变化与相关代谢物水平之间的相关性。基于这部分数据，作者进一步假设代谢物FBP与大肠杆菌ptsI酶的活性位点结合。首先，计算分析表明FBP可能是ptsI的竞争性抑制剂，而体外实验证实FBP降低ptsI活性。先前研究表明ptsI控制己糖摄取并调节糖酵解流量，有趣的是，FBP被证明是一种细胞内糖酵解流量传感器，因此，作者假设FBP-ptsI相互作用是一个负反馈回路，在糖酵解中间产物已经很丰富的情况下，可以防止过量的葡萄糖摄取，随后作者也通过实验验证这一观点。

生物过程是由分子间的相互作用和化学修饰来调节的，然而它们往往不影响蛋白质表达水平，因此在传统的蛋白质组学筛选中常被忽略。这项研究中利用LiP-MS的蛋白质结构读数可以原位检测到蛋白质功能变化，值得注意的是，这种方法并非唯一，其他技术例如交联质谱法也可用于此目的。总的来说，作者提出将不同条件下获得的蛋白质组动态原位结构数据结合起来，将能够扩大结构系统生物学的潜力。此外，对分子事件的定量检测，例如活性位点占用率，也能够支持生物系统建模框架的发展。通过将动态和高分辨率的结构数据与功能联系起来，使得距离细胞功能的三维模型构建更近一步。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.12.021

制版人：嘉

参考文献

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