小球藻多糖的分离纯化及理化性质

小球藻（Chlorella）是绿球藻目中的常见植物，属绿藻门，小球藻属，又称绿藻，它是地球上最早的生命形式之一，它是日本、中国等亚洲国家的传统食品。多糖是小球藻中重要的营养物质，占小球藻粉的10%～20%，具有抗衰老、抗氧化及增强免疫等生物活性功能。目前，市场上除小球藻片剂、胶囊等早期产品外，许多研究者还对小球藻饮料、面包、饼干等产品进行了深入研究，但对小球藻多糖类食品及多糖的理化特性鲜有报道。

天然多糖独特的流变学特性的研究可以预测其凝胶化或增稠性质，这不仅有助于食品的制造、分配、贮存和消费，而且有益于天然的凝胶剂、增稠剂或乳化剂的研发。因此，为了提高多糖产品的种类及应用，减少制作过程中的能量消耗，需要对小球藻多糖的理化性质进行初步研究。

为了进一步探索小球藻多糖的应用价值，南阳理工学院（河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室）的史瑞琴、马艳莉*和河北农业大学食品科技学院梁静静等人首先通过酶法提取小球藻粉中的粗多糖，探讨了不同脱蛋白方法对小球藻多糖的影响，确定离子交换柱层析获得的纯化多糖中是否含有大量蛋白以及是否为均一性组分。同时研究不同纯化多糖的微观形态、单糖组成、流变学等特性，这对于扩大小球藻在食品领域中的应用具有重要的意义及参考价值。

1 分离纯化及鉴定分析

1.1 脱蛋白方法的选择

• TCA法

由图1可得，蛋白质脱除率随TCA添加量的增加，先快速增加后基本维持于90%以上，最高可达95%。这是利用蛋白质阳离子在等电点与TCA结合形成不溶性盐。但TCA添加量增加的过程中，多糖损失率在持续上升且当添加量在2%～5%时，上升趋势十分明显，可导致多糖损失率达30%以上。此结果也验证了之前报道的结论。

• Sevag法

由图2可知，当采用Sevag法脱蛋白时，随着脱除蛋白次数的增加，蛋白质脱除率先缓慢增加后基本稳定于90%～95%之间。脱除蛋白次数小于6 次时，多糖损失率明显增加，随后基本保持于25%以下。本实验结果也证明循环6 次Sevag法脱蛋白不但可以使得蛋白质脱除率达92.27 %，而且能够保证多糖损失率相对较低。因此，为了减少TCA试剂对多糖结构的降解，本实验拟采用Sevag法脱蛋白。

1.2 阴离子交换柱层析

由图3可知，小球藻粗多糖经DEAE-SepharoseFast Flow柱层析可获得3 种不同级分的纯化多糖，分别命名为F 1 、F2、F 3 。其中F 1 为去离子水洗脱获得的多糖，冻干后为蓬松白色絮状物，而不同浓度（0.5、1、1.5 mol/L）NaCl溶液洗脱得到的F2与F 3 冻干后分别为淡黄色和乳白色蓬松絮状物。

1.3 紫外波长扫描

溶液在200～300 nm范围内的吸收峰可以验证多糖中是否含大量的蛋白质及核酸。从图4可以看出，多糖F 1 、F2、F3在260 nm与280 nm波长处几乎无明显的吸收峰，初步表明纯化多糖几乎不含蛋白质与核酸。

1.4 葡聚糖凝胶柱层析

本实验用Sephadex G-200层析柱分析。由图5可知，F 1 与F2的出峰时间接近，但与洗脱条件相同的F2相比，F 3 的出峰时间稍晚，由此推测F 3 的分子质量可能会略大于F2。从整体上看，纯化多糖均出现峰型基本对称的单峰，表明其接近于均一性组分。

2 结构性质

2.1 SEM分析

如图6A所示，F 1 表现为纤维细丝状，提高放大倍数可见明显的柱状结构，且表面平整，表明F 1 存在大量的分子或分子集团聚集形成的束。如图6B所示，F 2 呈现片状与碎屑状堆积，而放大5 000 倍时可见大量无规则交叉连接的立体网状结构，且表面粗糙，说明分子间的相互作用较强。如图6C所示，F 3 放大500倍时呈现片状堆积，扩大放大倍数可见明显的片状结构表面含有不同层析的凸起，说明此多糖内可能存在一些具有一定排斥力的聚集体。

2.2 HPLC分析

标准品、F 1 、F 2 与F3的单糖组成图谱分别见图7。不同纯化多糖的单糖组成及相对含量结果显示，F1中相对含量较高的单糖分别为Gal（62.898%）、Glu（15.439%）和Man（12.665%），F2也含有较多的Gal（41.854%）、Fuc（13.741%）、Rha（10.199%），而F3主要是由Rha（32.33%）、Ara（39.55%）、Gal（10.82%）组成。纯化多糖F 2 与F 3 均不含Rib，与之不同的是F1不含GlcA。综上分析可知，小球藻多糖是一种以Gal为主的杂多糖。

2.3 刚果红实验分析

由图8可知，随着NaOH浓度的增加，纯化多糖的最大吸收波长发生了相同程度的蓝移，说明纯化多糖在水溶液中不呈现三螺旋结构，而表现为无规则线团链构象。

3 流变学性质

3.1 静态黏弹性分析

结果显示，3 种多糖的表观黏度都与质量分数和剪切速率有关，且呈现出质量分数的正向变化和剪切速率的负效应。其中F 1 的黏度变化范围相对较小，F 2 与F 3 的质量分数依赖性会随着剪切速率的增加而逐渐减弱。依据非牛顿流体的特征可以确定小球藻多糖溶液为非牛顿流体。

3.2 动态黏弹性分析

结果显示，当角频率低于10 rad/s时，随着质量分数的增加F1的G’与G”也逐渐增加；当角频率高于10 rad/s时，质量分数增大虽然使得G”略有增加，但对G’影响不大。当角频率维持在0.1～10 rad/s之间，F1的G’与G”基本保持稳定，而角频率继续增加时，F1的G’与G”均呈现明显的上升趋势。

当角频率不变时，F2的G’与G”与质量分数呈正相关。当F2的质量分数高于1%时，角频率对G’与G”的影响相对较小，仅在接近100 rad/s时轻微增长；当质量分数为0.5%时，随着角频率的增加，G’与G”展示出明显的大幅度增加趋势。

与F 2 表现不同的是，当角频率在0.1～10 rad/s时，F 3 的G’与G”的质量分数依赖性不强，但质量分数高于1%时表现出质量分数依赖性增加；当角频率大于10 rad/s时，质量分数对G’与G”几乎不产生影响。当F 3 的质量分数不变时，F 3 的G’与G′随角频率的增加先稳定后显著增强。

在整个动态变化过程中，若G’＞G”则表现为固体的弹性行为，而G’＜G”表明溶液为类似液体的行为，出现交叉现象则说明多糖为凝胶型多糖。综上所述，相同质量分数的纯化多糖始终保持G’＞G”的状态，证明小球藻多糖为非凝胶型多糖。

结 论

以蛋白质脱除率和多糖损失率为指标，通过对比分析TCA法与Sevag法对小球藻多糖的影响，发现循环6 次以上的Sevag法效果较好。紫外扫描与Sephadex G-200柱层析的鉴定确定脱除蛋白后的小球藻多糖经过DEAESepharose Fast Flow柱层析可以获得几乎不含蛋白质的3 种均一性多糖。SEM、HPLC以及刚果红实验结果显示，纯化多糖主要以片状或细丝状形式存在，在水溶液中不呈三维螺旋结构，且证实了小球藻多糖是以半乳糖为主的杂多糖。流变学性质分析探明小球藻纯化多糖为非牛顿流体，而且是一类非凝胶型多糖。

本文《小球藻多糖的分离纯化及理化性质》来源于《食品科学》2020年41卷20期61-67页，作者：史瑞琴，梁静静，李大伟，王颉，郭书贤，马艳莉。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190515-173。