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近年来，受益于CRISPR/Cas9系统的不断发展，靶向DNA的碱基编辑技术成为了研究者便捷的改变生物基因组的实验操作手段。而后续Cas13系统的发现，为实现在生物过程中进行靶向的精确生物转录组辑以及转录组表观修饰提供了一种全新的研究方式【1】。Cas13家族蛋白天生具有靶向结合和切割沉默目的RNA的能力【2】。
迄今为止，据报道包括Cas13a（1250 aa），Cas13b（1150 aa），Cas13c（1120 aa）和Cas13d（930 aa）在内的Cas13效应蛋白均显示出高效的RNA敲除能力，且脱靶活性低。其中，2018年由加州大学伯克利分校Patrick Hsu实验室发现的Cas13d家族蛋白CasRx由于体积小，效率高，使得其更易于包装到慢病毒载体中以进行生物学进程研究，被认为是在未来应用中最具有优势的Cas13蛋白【3】。
CRISPR/Cas13系统不仅依赖其出色的靶向沉默RNA效率可被用于基因转录水平的调控，同时其靶向目的RNA的潜力也被认为可用于RNA碱基编辑或修饰。在Cas13进入研究领域的热点前，2019年8月，康奈尔大学的Shubing Qian课题组基于CRISPR/Cas9系统研发了RNA甲基化修饰编辑器用于操纵转录组上的m6A修饰,而受限制于Cas9系统自身的靶向DNA双链的特性，其需要额外合成PAMmer寡核苷酸序列来实现靶向操纵RNA修饰的目的【4】，但这确实为后续基于CRISPR/Cas13系统的RNA修饰编辑器提供了可借鉴的模板。
2020年5-7月，中山大学Hongshen Wang课题组以及哈佛大学David R. Liu课题组先后发表了利用切割活性失活的Cas13家族蛋白dCas13b与RNA去甲基化酶ALKBH55和RNA甲基转移酶METTL36融合的方法首次实现了基于CRISPR/Cas13系统对生物细胞转录组表观修饰的靶向编辑，证明了CRISPR/Cas13系统应用于RNA修饰研究的可行性。然而，受制于dCas13b分子体积大小以及靶向能力，该系统可能存在的难以进行病毒包装因而限制了其广泛应用。
2020年10月27日，西湖大学谢琦课题组在预印本平台bioRvix发表了一项题为“Epitranscriptomic editing of the RNA N6-methyladenosine modification by dCasRx conjugated methyltransferase and demethylase ”的研究成果。
该研究首次构建了基于慢病毒载体的切割活性失活的dCasRx RNA m6A甲基化编辑器，在293T细胞以及难以直接转染的胶质瘤干细胞细胞中，实现了RNA特异性位点的甲基化修饰操纵（图1）。
图1 基于CRISPR/CasRx系统的RNA甲基化修饰编辑器示意图
他们将细胞核定位的无催化活性的CasRx（dCasRx）与m6A “书写器”METTL3或“橡皮擦”ALKBH5蛋白相融合，以实现细胞中对于特定m6A位点甲基化水平的双向调控。这说明CasRx作为CRISPR/Cas13系统的成员，可以应用于RNA转录后修饰的研究。同时，凭借dCasRx转录组编辑器体积小的优势，他们将其包装到慢病毒中，允许其对难以进行质粒转染的胶质母细胞瘤细胞进行感染表达，验证了其编辑系统应用于难转染的细胞中转录组甲基化修饰的可行性以及相应位点所具有的生物学功能。
此外，该研究团队利用该甲基化编辑系统，对于2020年6月康奈尔大学Samie R. Jaffrey课题组提出的 YTHDF1，YTHDF2和YTHDF3共同起作用以介导含m6A的mRNA的降解的全新的功能模型7进行了验证。通过基于dCasRx甲基化编辑器，他们能够对在YTH家族成员（DF1,DF2,DF3）相关的m6A位点的甲基化水平进行有控制的操纵并测量mRNA降解速率的变化，进一步探索YTH家族成员在细胞中的功能作用。他们发现，相较于传统的不同YTH家族成员在细胞中介导增强翻译效率以及调控转录本降解等不同功能的模型8，他们的结果与新的功能模型有着更高的契合度，不同YTH 家族成员结合的RNA m6A位点的甲基化水平升高都会增强所指定的內源转录本的降解，而甲基化水平的降低则可以增加对应转录本的稳定性。需要指出的是，该项实验仅仅在293T细胞中验证了YTH家族成员的作用模型，至于该模型是否可以推广到其他细胞或组织还有待验证。
这项研究表明了CasRx的有效性和广阔的应用前景。基于dCasRx的转录组表观修饰编辑器的出现，为进一步探索原代细胞，以及难以转染癌细胞转录组提供了一种有效策略。同时，参照CRISPR/Cas9技术的高通量功能性基因组筛选的成功，dCasRx表观转录组编辑器同样具有高通量筛选m6A的潜力，这一点为今后实现功能表观转录组筛选提供了潜在的工具。
原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.27.356436v1
参考文献
1. Abudayyeh, O.O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.Science353, aaf5573 (2016).
2. Abudayyeh, O.O. et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13.Nature550, 280-284 (2017).
3. Konermann, S. et al. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.Cell173, 665-676 e614 (2018).
4. Liu, X.M., Zhou, J., Mao, Y., Ji, Q. & Qian, S.B. Programmable RNA N(6)-methyladenosine editing by CRISPR-Cas9 conjugates.Nat Chem Biol15, 865-871 (2019).
5. Li, J. et al. Targeted mRNA demethylation using an engineered dCas13b-ALKBH5 fusion protein.Nucleic Acids Res48, 5684-5694 (2020).
6. Wilson, C., Chen, P.J., Miao, Z. & Liu, D.R. Programmable m(6)A modification of cellular RNAs with a Cas13-directed methyltransferase.Nat Biotechnol(2020).
7. Zaccara, S. & Jaffrey, S.R. A Unified Model for the Function of YTHDF Proteins in Regulating m(6)A-Modified mRNA.Cell181, 1582-1595 e1518 (2020).
8. Zaccara, S., Ries, R.J. & Jaffrey, S.R. Reading, writing and erasing mRNA methylation.Nat Rev Mol Cell Biol20, 608-624 (2019).
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