顶刊综述：生物3D打印在骨骼肌组织工程中的应用

骨骼肌组织工程旨在替换或恢复因疾病、事故或严重手术而受损或丧失部分功能的骨骼肌，通过培养从患者体内获得的肌源性祖细胞或干细胞，直接培养或搭载支架上来制备出可以植入患者体内的功能性骨骼肌。骨骼肌组织工程在再生医学以及基于细胞分析的生物机器人、生物传感、能量收集和药物筛选方面都有广泛地应用。但如何利用现有的组织工程制造方法来重现肌肉的复杂性仍然是一个挑战。

来自美国加州大学的Ali Khademhosseini教授团队在Small杂志上发表了题目为“3D Bioprinting in Skeletal Muscle Tissue Engineering”的综述文章，简述了骨骼肌的解剖结构并从打印工艺、墨水配方及性能、生物3D打印技术在表面贴装技术方面取得的进展等角度概述了生物3D打印技术在骨骼肌组织工程中的应用。

人体共有600多块不同的骨骼肌，约占全身重量的45%，共同参与骨骼支持，维持各类运动的稳定性和协调性，以及新陈代谢的调节。骨骼肌解剖学结构如图1所示，骨骼肌是由具有收缩能力的肌细胞或肌纤维所组成，薄层结缔组织包裹的肌肉纤维轴向排列形成一束，外侧由结缔组织所覆盖和接合在一起。骨骼肌还与接收营养和清除废物的血管网相连，与激活和收缩的神经网络相连，并通过肌腱与骨骼相连。

图1 骨骼肌解剖学结构

研究现状为了改善骨骼肌细胞分化并获得具有高功能性的肌肉组织，目前已经开发了具有特定形貌特征、硬度、导电性、聚合物成分和可溶性因子的支架。此外，通过使用骨骼肌细胞与成纤维细胞的共培养物来工程化肌腱连接，或与内皮细胞共培养来获得血管化肌肉。为了进一步改善工程肌肉的功能，研究人员致力于模拟体内骨骼肌的结构和微环境。所有传统方法的一个共同点是制造各向异性支架，以允许肌肉细胞排列和促进肌肉生成。然而，这些方法在诱导精确的3D空间细胞组织方面有局限性。如图2所示，3D 生物打印技术旨在通过在细胞和基质沉积中提供高精度来克服这些限制，从而快速制造复杂结构或与神经细胞一起获得神经肌肉连接，来制造更复杂的工程化组织。

图2 常规方法和生物3D打印方法所制备的骨骼肌组织。a. 3D打印肌腱链接。b.利用静电纺丝工艺进行肌腱刚度调节。c.设计芯片控制神经与肌肉的连接。d.在3D打印的水凝胶结构上共培养肌肉和运动神经元。

生物3D打印沉积策略生物3D打印是指可用于制造包含细胞和材料的3D物理结构的技术。如图3所示，常用技术包括挤出打印、喷墨打印、激光辅助打印和立体平面打印。喷墨打印基于一滴一滴的生物墨水沉积，并使用不同的操作机制，如热、压电、静电、声学、流体动力学和微型阀来产生生物墨水液滴。挤出打印依赖于使用气动或机械压力推动生物墨水通过喷嘴。生物墨水沉积，通过在平台上沿X-Y方向光栅扫描打印头而发生，打印头或载物台沿 Z 方向移动，允许逐层放置。在激光辅助打印中，玻璃或石英带被一薄层金属覆盖，然后装载生物墨水。激光脉冲诱导金属膜蒸发，形成高压气泡，将生物墨水液滴推向基底。在立体平面打印中，激光以逐点方式固化光敏树脂，形成 3D 结构。基于投影式光固化的3D打印(DLP)使用数字微镜阵列器件，该器件由数百万个可单独寻址的微镜组成，这些微镜可以打开或关闭，以逐层的方式固化目标投影3D结构的整个平面。DLP为使用微米分辨率打印3D结构提供了卓越的速度、分辨率、可扩展性和灵活性。

图3 三种主要的生物3D打印策略

生物墨水配方天然和合成的聚合物已被广泛应用于生物3D打印骨骼肌的墨水配方。在天然聚合物中，快速交联水凝胶如藻酸钙或纤维蛋白已经直接用作生物墨水或在打印过程中用作支撑材料，以保持不太稳定的生物材料的可打印性。其他天然水凝胶，如藻酸盐、胶原和明胶，已被广泛用于为工程化组织提供物理支持和细胞支持功能。此外，通过负载富含自体生长因子的血小板血浆的藻酸盐生物来制备组织工程支架可增强血管生成、减少炎症、干细胞募集以及心血管和骨骼肌组织再生。如图4所示，近15年来，为了精确调节天然聚合物的机械性能，研究人员已经开发出各种化学官能团如甲基丙烯酰基与天然聚合物共轭，使它们可通过自由基聚合发生光交联。GelMA、HAMA、PEGDA、SilMA、AlgMA、DexMA、CSMA等可快速光交联的水凝胶材料通过各种混合配方可获得优异的生物学性能，可以打印出具有不同形状、浓度和机械性能的载细胞水凝胶构建体。此外，营养物质向细胞的传递是大尺度组织制造和维持中的关键问题，目前研究人员已经做了大量工作来促进肌肉组织中的血管化网络。例如，使用同轴喷嘴来制造中空结构，通过在复合 GeLMA(3.5-5%)-藻酸盐(4%)生物墨水打印内皮细胞和新生心肌细胞而获得血管化的心脏组织。此外，包括肝、心脏、软骨、皮肤、脉管系统、脑、肺、肾、骨、脊髓、结肠、脐带、胰腺、脂肪组织和骨骼肌来源的dECM的生物墨水也被广泛应用于构建功能化复合生物墨水。

图4 近15年来已发表的论文中，生物3D打印骨骼肌所用材料的百分比

生物3D打印在骨骼肌组织工程中的应用生物3D打印能够实现细胞的精确定位和排列。例如，将小鼠成肌细胞(C2C12)精确地分布在悬浮的水凝胶基质中并可功能化形成具有生理反应的肌管。如图5a所示，Bashir 和他的同事通过3D打印技术制造了一种生物装置，由两个不同长度的刚性柱子通过柔性梁连接而成。溶液中的 C2C12、细胞外基质蛋白和基质凝胶被浇铸在柱子周围和柱子之间并凝胶化剥离，凝胶的压实和两个支柱之间诱导的张力有利于肌管的成熟，在电脉冲刺激下肌管可发生收缩使该结构进行类似尺蠖的爬行运动。如图5b所示，由一对对抗的骨骼肌组织驱动的生物混合机器人是由3D打印的树脂骨架组成，承载用于主动刺激负载成肌细胞的水凝胶片的电极，该水凝胶片安装在骨骼的两侧以充当拮抗肌。该生物混合机器人能够进行关节旋转角度接近 90°的移动，可以用来执行简单的动作。

图5 组织工程机器人。a. 3D打印水凝胶基质的“生物机器人”，具有不对称的物理设计，可由组织工程培养的哺乳动物骨骼肌条驱动。b.由一对对抗性骨骼肌组织驱动的生物工程机器人。

增材制造在骨骼肌组织功能化构建上的优势如图6所示，静电纺丝技术可制造出有序或无序的聚己内酯微纤维束，用胶原涂覆微纤维可模拟天然肌肉，可进一步在其表面用2%胶原-2%聚环氧乙烷(PEO)生物打印 C2C12。与无序的纤维支架相比，在胶原包被的有序纤维和有序纤维支架上可以观察到更高的肌节组织和分化。在另一项关于眼内压的研究中，使用由明胶、纤维蛋白原、透明质酸和甘油组成的生物墨水负载C2C12 进行打印，可观察到打印后 97%的细胞活力，细胞排列有序，且在分化培养基中 7 天后可形成肌管，将构建物皮下植入裸鼠体内，将解剖的腓总神经插入构建物中，可观察到构建体中的神经整合，在肌纤维和神经接触上存在乙酰胆碱受体簇。此外，构建体的血管化是通过内皮细胞标记物的表达来诱导的，而肌电图显示工程肌肉对电刺激有反应，并且仍然是未成熟的。此外，微流控技术与生物3D 打印技术相结合，使骨骼肌组织工程可以实现更复杂结构的制造。例如，利用微流控打印头精确划分两种不同的光固化墨水，两种墨水分别与 C2C12 和 BALB/3T3 成纤维细胞复合，再进行复杂结构打印，可实现两种细胞类型区室化生长，连续培养可形成排列整齐的多核全条纹肌管，将构建体植入小鼠皮下，分析可获得紧密排布的的完全成熟的全条纹肌管。

图6 骨骼肌组织工程中的增材制造。a. 模拟骨骼肌分级组织的混合微纤维化聚己内酯/胶原支架的制造工艺和光学/扫描电子显微镜图像。b. 3D打印脱细胞支架，以促进成肌细胞分化。c.仿生组织构造。肌肉前体被包裹在由PCL柱支撑的水凝胶纤维内。d.微流控精确制造含有成肌细胞和成纤维细胞的异质性水凝胶纤维。

综上所述，生物3D 打印技术在组织工程、再生医学和药物开发方面具有巨大的潜力。该技术有助于克服移植器官的短缺，为构建健康或患病的组织模型提供了重要的工程化方法。

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