Nature | 人基因组复制过程中姐妹染色单体的构象

撰文 | 十一月

责编 | 兮

3D基因组结构支持基因表达调控、重组、DNA修复以及有丝分裂过程中的染色体分离。染色体构象捕获技术（Hi-C）可以用以分析细胞中染色体中复杂的基因组景观，但是目前姐妹染色单体由于其序列相同还很难确定它们如何在复制的染色体中相互作用。

近日，奥地利科学院分子生物技术研究所Daniel W. Gerlich研究组与Michael Mitter（共通和一作）在Nature期刊上发表了文章Conformation of sister chromatids in the replicated human genome，建立了能够捕获姐妹染色单体的Hi-C技术scsHi-C并揭开了姐妹染色单体的拓扑结构图谱。

基因信息的表达、维持和遗传依赖于染色体DNA分子内部和之间高度调控的拓扑相互作用。这包括分子内的相互作用比如启动子与远距离的增强子调控基因表达【1】，而分子间的相互作用包括姐妹染色单体的同源DNA序列之间的相互作用促进DNA损伤修复【2】。为了区分复制染色体中的相同DNA序列分子内和分子间的相互作用，作者们建立了scsHi-C测序技术。为了对顺式和反式姐妹染色单体内DNA相互作用进行解析，首先需要引入一个姐妹染色单体特异性标记物，通过在DNA核苷酸类似物存在的情况下培养细胞进行一轮DNA复制来实现在两条姐妹染色单体中分别标记沃森链（Watson strand）和克里克链（Crick strand）。如果核苷酸类似物可以通过DNA测序检测到，那么标准的Hi-C实验步骤就可以用以将染色单体相互作用进行分类，将同一条链上相互作用称为cis顺式作用或不同链上的trans反式相互作用（图1）。为了建立姐妹染色单体特异性DNA标记，作者们考虑使用4sT（4-thio-thymidine），因为4sT的RNA同源物4sU可以在不影响细胞生存能力的情况下对新生的RNA进行标记【3】。另外，TUC-seq（Thio-uridine-to-cytidine sequencing）技术【4】使用4sT标记与提取后的OsO4/NH4Cl转化化学相结合产生明显的点突变。作者们考虑如果能在基因组DNA纯化后将4sT转化成为5mC（图1），那么就可以对4sT标记的DNA产生特征突变进行高通量测序。通过对4sT标记的DNA被OsO4/NH4Cl处理后的转化效率以及4sT本身对细胞的毒性进行检测后，作者们发现4sT标记的DNA能够被高效率转化同时对细胞几乎没有毒性，完全符合活细胞中进行姐妹染色单体基因组DNA标记的全部要求。

图1 scsHi-C测序技术原理

进一步地，作者们对4sT标记基因组DNA的效率进行评估。在4sT处理组与非处理组中分别进行基因组纯化以及OsO4/NH4Cl处理后扩增和高通量测序。通过测序以及质谱检测，作者们发现全基因组特征性突变的总频率达到2.5%。为了进一步完善scsHi-C的步骤，作者们对HeLa细胞进行同步化并将进入S期细胞释放到包含4sT的培养基中，随后使用CDK1的抑制剂将细胞滞留在G2时期。然后作者们将染色质进行交联、消化、生物素标记、连接以及纯化，随后进行标准的Hi-C实验方案【5】。作者们发现与未进行处理的细胞相比，Hi-C的图谱中所有的相互作用非常相似的，说明4sT处理并不会破坏基因组结构。另外，作者们也发现scsHi-C能够准确地区分顺式与反式的相互作用。

为了确定姐妹染色单体在间期相互作用的位置以及测量姐妹染色单体在有丝分裂期间的分解程度，作者们构建了与G2或有丝分裂前中期同步的细胞全基因组scsHi-C图谱。scsHi-C揭示了姐妹染色单体在细胞间期的整体配对以及在有丝分裂时几乎完全分离。另外，作者们通过全基因组scsHi-C图谱分析以及遗传学实验发现cohesin蛋白中的一部分会介导复制后的DNA分子之间的连接，用以维持DNA复制后姐妹染色单体；另外一部分的cohesin蛋白在G2期的TADs结构域中负责动态地形成DNA环分离姐妹染色单体（图2）。除此之外，作者们还发现CTCF为环挤出的cohesin蛋白以及负责凝聚作用的cohesin蛋白提供边界。姐妹染色单体在H3K27me3富集区域仍然高度成对出现，这可能是通过局部动态环挤出频率出现降低或由独立于cohesin的polycomb抑制性染色质的结合（图2）。

图2 姐妹染色单体分子间与分子内的相互作用模型图

总的来说，作者们建立了能够对姐妹染色单体进行构象解析的Hi-C技术：scsHi-C，通过建立姐妹染色体单体全基因组图谱丰富了大家对于姐妹染色单体拓扑结构的认识，使得对相同DNA分子之间的物理相互作用如何促进DNA修复、基因表达、染色体分离以及其他潜在的生物过程的研究成为可能。

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2744-4

制版人：琪酱

参考文献

1Sc hoenfelder,S. & Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expressioncontrol.Nature reviews. Genetics20 , 437-455,doi:10.1038/s41576-019-0128-0 (2019).

2Hustedt, N. & Durocher, D. The control of DNArepair by the cell cycle.Nature cellbiology19 , 1-9,doi:10.1038/ncb3452 (2016).

3Herzog, V. A. et al. Thiol-linked alkylation of RNA to assess expression dynamics.Nature methods14 , 1198-1204, doi:10.1038/nmeth.4435 (2017).

4Gasser, C. et al. Thioguanosine Conversion Enables mRNA-Lifetime Evaluation by RNASequencing Using Double Metabolic Labeling (TUC-seq DUAL).Angewandte Chemie (International ed. in English) 59 , 6881-6886,doi:10.1002/anie.201916272 (2020).

5Mumbach, M. R. et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genomearchitecture.Nature methods13 , 919-922, doi:10.1038/nmeth.3999(2016).