Cell | 胎儿和胎盘的免疫防御如何建立？蜕膜NK细胞转移颗粒溶素选择性杀灭滋养细胞中的细菌

撰文 | 章台柳

胎儿细胞和母体细胞在绒毛处相互接触，即母体血液在合胞体绒毛滋养层（VT）进行营养交换，胎儿绒毛外滋养层（ETV）在母体蜕膜处将绒毛固定在子宫上。VT合胞体能抵抗一些细菌感染，而ETV对感染的敏感性更高，可被多种病原体感染。母体感染可通过滋养层传播至胎儿，可导致胎儿窘迫和丢失、早产、先天性畸形和宫内生长受限等严重后果【1】。

蜕膜NK细胞（dNK）是妊娠早期母胎界面最丰富的免疫细胞，是预防胎盘感染的主要细胞。其表达高水平的细胞溶解效应分子穿孔素（PFN）、颗粒酶（Gzms）和颗粒溶解素（GNLY），且dNK对典型NK和外周血NK（pNK）的靶细胞没有杀伤作用。dNK可以杀死人巨细胞病毒感染的蜕膜（母体）基质细胞，但不会脱颗粒或杀死感染的（胎儿）绒毛外滋养层（EVT）和VT【2】。dNK对感染的VT和EVT细胞的耐受或与滋养层细胞的特殊特征有关：VT不表达MHC-I或已知的NK激活配体；EVT仅表达HLA-C和非典型MHC分子。dNK可分泌IL-8、VEGF和GM-CSF等细胞因子，可增加滋养层细胞迁移、子宫螺旋动脉重塑、胎盘形成和子宫血管形成。耐受性胎盘环境有利于胎儿和胎盘的发育，但会干扰免疫防御。所以，胎儿和胎盘的免疫防御如何建立，dNK细胞对EVT和VT耐受的分子机制如何，这些问题都有待进一步研究。

颗粒溶素（GNLY）是杀伤性淋巴细胞表达的抗菌肽，能选择性破坏细菌、真菌和寄生虫的膜。大多数哺乳动物（不包括啮齿类动物）都表达GNLY，其激活需要从15kDa的前体切割成9kDa激活态。颗粒成孔蛋白PFN可选择性损伤哺乳动物细胞膜，而不是微生物膜。当杀伤细胞识别受感染细胞时，细胞毒性颗粒移动到免疫突触，并将其细胞毒性颗粒蛋白释放到突触中。PFN可运送GNLY和Gzms到受感染的宿主细胞，Gzms杀伤宿主细胞，GNLY将Gzms传递到细胞内微生物中，引发微生物程序化死亡。因此，杀伤细胞介导的细胞内微生物死亡需要三种细胞毒性效应分子：PFN、Gzms和GNLY【3】。高浓度的GNLY自身可裂解细菌，但低浓度时需依靠Gzms裂解细菌。dNK比pNK表达更高的GNLY，可分泌GNLY，但GNLY在dNK抵抗胎盘内感染过程中的作用未知。

2020年8月20日，来自哈佛医学院的Judy Lieberman和哈佛大学的Tamara Tilburgs、Jack L. Strominger合作在Cell杂志上发表文章Decidual NK Cells Transfer Granulysin to Selectively Kill Bacteria in Trophoblasts，发现人dNK细胞高表达抗菌肽GNLY，并选择性通过纳米管结构传递到绒毛外滋养层细胞中，从而实现杀伤胞内感染的李斯特菌，而不杀伤滋养层细胞。与缺乏GNLY的野生型小鼠相比，李斯特菌感染妊娠期的GNLY转基因小鼠时，其胎盘和胎儿的李斯特菌负荷较低，妊娠成功率显著提高。此外，pNK也可转移GNLY来杀死巨噬细胞和树突状细胞中的细菌，而不会杀死宿主细胞，说明这种免疫防御不局限于怀孕。

健康孕早期胎盘的dNK细胞表达GNLY和其他细胞溶解颗粒蛋白（PFN、GzmA和GzmB），且dNK中激活性和总的GNLY比pNK高10倍，PFN低10倍。低浓度IL-15过夜培养实验中，dNK分泌的GNLY是pNK的20倍，且都是激活态，同时分泌的GzmA、GzmB和PFN远低于GNLY。定位实验发现GNLY存在于细胞毒性颗粒和胞浆中，而PFN只存在于颗粒中。那么分泌的激活态GNLY是否能杀死细菌？dNK细胞上清可减少李斯特菌（Lm）数量，但不能减少滋养层细胞系JEG-3胞内感染的Lm；dNK或pNK细胞可显著减少胞内感染的Lm，同时不杀伤滋养层细胞或释放细胞毒性颗粒。使用GNLY的阻断抗体能抑制dNK或pNK的细菌杀伤功能，而抑制脱颗粒、PFN或Gzms都不能抑制其细菌杀伤功能。此外，dNK和pNK对胞内感染Lm的杀伤需要细胞间接触。研究人员进一步在原代滋养层细胞（1o EVT）和组织中验证，dNK可杀死细胞内的Lm，显著降低细菌负荷，同时不会杀死被感染的EVT细胞。

那么dNK如何对胞内感染的Lm进行杀伤？首先研究人员发现dNK和JEG-3共培养，导致JEG-3胞内的GNLY而不是GzmB显著增加；同样的现象也发生在dNK和原代滋养层细胞VT和ETV共培养，细胞因子激活的pNK（GNLY表达增加）和JEG-3共培养时。其次，利用共聚焦显微镜发现dNK细胞通过形成纳米管与滋养层细胞相连，单向传递GNLY。纳米管的形成和GNLY的传递需要actin细胞骨架而不依赖于内吞作用或微管结构，同时抑制actin多聚化可抑制dNK或pNK对胞内细菌的杀伤。进一步研究发现，NK细胞通过识别唾液酸化的JEG-3细胞配体促进纳米管形成、GNLY的转移和细胞内Lm的控制。此外，dNK和pNK也可向其他细胞如1o EVT单核来源的巨噬细胞、蜕膜巨噬细胞、THP-1分化成的DC传递GNLY，杀伤其胞内感染的Lm同时不杀伤细胞；有趣的是，dNK和pNK可向人包皮成纤维细胞（HFF）、Hela细胞和U-251胶质母细胞瘤等传递GNLY，但不杀伤胞内感染Lm。

野生型小鼠不表达GNLY，研究人员构建了GNLY转基因小鼠对GNLY在怀孕期间Lm感染的作用进行研究。和人类似，子宫NK（uNK）分布在孕鼠子宫，分泌GNLY，而脾脏NK（sNK）不能分泌GNLY。与野生型小鼠相比，GNLY转基因小鼠来源的uNK和sNK显著减少小鼠滋养层细胞系SM9-1的胞内感染Lm，对细胞没有杀伤，同时对胞内感染Lm的杀伤依赖于GNLY，而不依赖于PFN，表型与人dNK和pNK类似。对孕早期的小鼠进行亚致死剂量的Lm感染，野生型小鼠的脾脏和肝脏有较高的细菌负荷，而1/3的GNLY转基因小鼠的脾脏和肝脏检测不到细菌，其他小鼠的细菌负荷也远低于野生型小鼠。而且，GNLY转基因小鼠的胎盘和胎儿的细菌负荷显著低于野生型，怀孕成功率大大增加。一旦去除NK和CD8 T细胞，则GNLY转基因小鼠对胎儿的保护被破坏，即杀伤性淋巴细胞中的GNLY可显著降低妊娠GNLY转基因小鼠的细菌负荷，并保护小鼠免受Lm诱导的流产。

总的来说，该研究揭示了dNK通过形成纳米管与滋养层细胞相连，传递GNLY并杀伤胞内感染的细菌，从而实现对细菌感染的控制，同时保持母体-胎儿屏障的完整，为我们了解dNK的功能提供新的视角。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.07.019

制版人：十一

参考文献

1. B1aszkowska, J., and Go ralska, K. (2014). Parasites and fungi as a threat for prenatal and postnatal human development.Ann. Parasitol.60, 225–234.

2. Crespo, A.C., Strominger, J.L., and Tilburgs, T. (2016). Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection.Proc. Natl. Acad. Sci. USA113, 15072–15077.

3. Dotiwala, F., Mulik, S., Polidoro, R.B., Ansara, J.A., Burleigh, B.A., Walch, M., Gazzinelli, R.T., and Lieberman, J. (2016). Killer lymphocytes use granulysin, perforin and granzymes to kill intracellular parasites.Nat. Med.22, 210–216.