潜在的患者特异性植入物：生物3D打印仿生三层半月板

股骨髁与胫骨平台之间存在的半月骨楔形纤维软骨组织的区域称为膝关节半月板。由于运动、创伤和与年龄有关的并发症，半月板容易受伤。骨关节炎变性的发生在半月板撕裂的患者中很普遍，并可能因切除和矫正手术的失败而加重。目前，半月板组织在血管化区域的愈合是成功的，但无血管区域的愈合受损并伴有机械性能较差的纤维组织的形成。

以往报道的修复和再生半月板组织的方法包括在缺损部位传递前体细胞以及合成和天然生物材料基支架的全部或部分替换，然而传统的支架制造技术缺乏对患者特定几何形状以及半月板的内部结构和体积力学性能进行重述的能力。采用三维（3D）打印策略辅助的组织工程原理来制造半月板组织构造可以帮助半月板损伤患者恢复活动性，改善疼痛程度并降低患膝骨关节炎的风险。

因此，Biman B Mandal和Ashutosh Bandyopadhyay基于一种具有高打印保真度的可剪切稀疏的新型丝素蛋白-明胶基生物墨水，采用3D生物打印技术制造仿生三层半月板，以用作潜在的半月板植入物。仿生半月板的内部纤维结构包含周向层状和放射状纤维，随后是网格网格区域作为顶层。打印所用的生物墨水是从桑树和非桑树蚕蛾中得到的丝素蛋白（SF）与明胶的混合物，用来模仿半月板的细胞外微环境，用原代猪半月板纤维软骨细胞对支架的生物相容性进行了表征。这种3D打印支架可被微调成目前的半月板修复临床治疗方法的可行替代方案。

https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab40fa

该论文发表在Biofabrication杂志上题为“A three-dimensional printed silk-based biomimetic tri-layered meniscus for potential patient-specific implantation”的文章，来自印度理工学院的Biman B Mandal团队。

图1 3D生物打印实验示意图

首先，作者对打印的生物墨水SF和明胶的共混物进行了优化，通过诱导凝胶形成可以改善剪切稀化，不仅提高了水凝胶的可打印性，而且通过EDC / NHS化学交联以制造结构坚固且高度可压缩的支架。为了评价其在模拟半月板组织的物理化学和力学性能方面的适用性，进行了一系列的理化性质测试，网格结构的溶胀表征发现其吸收的PBS为其干重的7倍以上，表明支架高度多孔且可以保持水分，可以通过扩散促进营养物质和代谢物的交换。可降解性实验显示21天后，在蛋白水解条件下，结构在保留了20%的重量。以上结果表明，该生物墨水具有优良的机械、溶胀和降解性能。

图2 (A)简化半月板三层模型的示意图。(B)网格、同心和片层填充的场发射扫描电子显微镜图像。(C)侧面和(D)顶部视图的代表性完整的三层半月板支架印刷红色染料。

然后，作者对半月板支架进行了生物学特性的研究，结果表明用半月板纤维软骨细胞种子的结构在培养21天内表现出良好的细胞活力，细胞在不同的播种密度下增殖1.8至2次，没有明显的细胞毒性，层状填充结构的不同深度和平面上的细胞均匀地分布并附着在支架上。通过测定小鼠巨噬细胞在体外支架存在下释放的IL-1β，比较了它们的巨噬细胞刺激能力，该支架表现出优异的免疫相容性。接着用H&E对培养21天后的支架进行组织学染色，显示细胞在支架网格内分布均匀。用AlcianBlue对sGAG进行组织化学染色显示sGAG在支架上均匀分布的丰富沉积。sGAG和胶原蛋白的分布显示了细胞的位置和支架内的最大沉积面积。

图3 (A)用活死染色法观察1天后半月板来源的原代猪纤维软骨细胞种子构建物的体外细胞相容性。(B)用不同细胞播种密度的打印体alamarBlue法测定细胞增殖。(C)细胞增殖指数表示为不同细胞密度的印刷结构之间在21天内的归一化。(D)打印丝纤维的体外免疫相容性评估通过ELISA检测RAW264.7细胞中小鼠IL-1β释放，构建了与TCP和LPS有关的ROIN结构。

图4 用纤维软骨细胞播种并在体外成熟21天的网格代表性染色图像，并在体外成熟21天。(A)用H&E染色的切片显示网格内细胞的分布和排列。(B)蓝染切片，显示纤维软骨细胞沉积s GAG。(C) Picrosirus红染切片，显示胶原纤维软骨细胞沉积。

最后，他们进行了体内生物相容性评估实验，将无细胞的支架皮下植入大鼠中，发现该支架在长达7天被宿主细胞浸润的同时是完整的，并在14天后随着细胞和宿主组织的大量浸润而最终降解。在14天，支架被降解，并显示一个骨骼框架，已经渗透到宿主细胞和组织。此外，巨噬细胞在附近不可见，这表明了支架在体内的免疫相容性、可降解性和整合潜力。虽然该支架包含了弯月面缺陷修复的潜力，但仍需要将其实际植入到缺陷部位以评估越来越大的动物的承重和再生。在不久的未来，我们相信3D生物打印半月板可以作为临床治疗的可行替代方案。

图5 H&E和CD68抗体染色图像显示(A)7天和(A)7天后取回的小鼠皮下植入交联生物支架的体内细胞浸润和免疫相容性 (B)14天。