基于第二代RHS技术开发的转基因玉米MON 87429

杂种优势会使杂交作物比其近交亲本的产量更高。对于高纯度的杂交种子，消除自花授粉至关重要。手动或机械去雄（例如玉米中的去雄）会消耗大量的人力物力，并且对雌性植物会造成物理损害，导致种子产量减少。许多雄性不育系统不仅需要维持者来进行雄性不育系繁殖，而且经常受到环境因素的影响。Roundup杂交系统（RHS）利用草甘膦诱导雄性不育，有效地消除了对用于商业化杂交种子生产的保持系和雄性不育的需求。

第一代RHS技术研发的产品MON 87427利用特定的启动子和内含子降低了草甘膦抗性基因cp4 epsps在母本花粉中的表达量，使得草甘膦在玉米散粉期之前或期间的喷施能够阻碍花粉的发育和散粉，从而可以作为不育系使用。

1 玉米的商业化生产

杂交种子生产在现代农业中占主导地位，因为杂种可以改善所得植物的特征，如产量、均匀性、颜色和抗病性等，这种现象称为杂种优势。杂交种子是通过异花授粉植物产生的，并且为了在连续几代中保持杂交种子的高纯度，避免自花授粉是至关重要的。例如在玉米生长过程中，杂种遗传纯度受污染的主要原因是母本的自花授粉。

目前已经使用多种方法来防止玉米杂交种子生产期间雌性近交亲本的自花授粉，包括人工去去雄或雄性不育系统的发育。然而，玉米中的去雄会消耗大量的人力物力（劳动密集型），并且雄性不育系统需要产生保持系以恢复育性，使雄性不育系可以繁殖。

2 RHS2 - 诱导型雄性不育的方法

针对Roundup和其他以草甘膦为主要成分的除草剂所需的酶用于植物生存。孟山都公司的科学家已经开发出一种精确控制草甘膦对玉米的影响的方法。通过插入表达草甘膦不敏感的转基因使草甘膦产生耐受性，然后使用RNA干扰（RNAi）来关闭这种耐受性基因，从而产生草甘膦敏感性。通过将靶标置于对仅表达雄性组织的siRNA特异性的耐受基因中，科学家们已经开发出一种通过在生长后期应用草甘膦除草剂诱导雄性不育的方法（RHS2）。选择性诱导雄性不育的能力有效地消除了对保持系的需要和去雄部分以用于商业化杂种种子的生产。

图1 双重效用 CP4 EPSPS蛋白（由耐受性转基因产生）通常在营养和雌性组织中积累，在控制杂草时提供了良好的草甘膦喷雾保护，因此可以维持近交系。相比之下，在雄性生殖细胞中存在很少的CP4 EPSPS蛋白。在对花粉发育至关重要的阶段喷洒草甘膦时，将诱导雄性不育，并且植物可以用作雌性亲本以产生杂种种子

3 鉴定mts-siRNA

为了鉴定雄性组织特异性小干扰RNA（mts-siRNAs），科学家采用了Seq-Array策略，最初在各种玉米组织上进行高通量测序以鉴定小RNA序列。然后使用定制化的芯片技术选择富含雄穗siRNAs来进一步评估的WT植物群体。联川生物的μParaflo芯片技术可在芯片上实现大规模平行寡核苷酸和肽合成。该技术提供了一种快速且经济的方法，用于生产小批量或大批量的芯片，其探针基于从高通量测序数据定制。芯片数据来自设计用于检测强度超过500的 mts-siRNA在一组器官中表现出流苏特异性表达的结果的定制化芯片。

图2 10个具有代表性的抽穗特异性mts-siRNA

4 种质外显率

内源性mts-siRNA存在于种质实现最佳种质外显率的范围内。科学家们再次使用芯片来测试在北美常见的其他代表性玉米种质的抽穗中是否存在mts-siRNAs。这些芯片实验表明，大多数mts-siRNA存在于来自其他30种近交种质的穗中。

图3 mts-siRNAs A至J在另外30个玉米种质的V8穗的芯片信号强度图

5 选择商业化转基因事件

而后，科学家们选择了一个cDNA序列EU974548，其中含有富含潜在mts-siRNA靶标的区域，序列匹配完整，之前已通过表达序列标签的大规模测序从玉米杂种中分离出来。利用PCR技术，研究者确定EU974548序列存在于北美种植的不同玉米种质中，并且使用多个序列数据库的生物信息学检索证实EU974548序列存在于世界各培育的代表性种质中，表明EU974548序列是在玉米中具有保守性。保守性的mts-siRNAs和EU974548序列适用于广泛的玉米种质，因此EU974548序列成为用于转基因调控研究的理想选择。经过多年的田间试验、功能效率实验和分子特征的评价，MON 87429被选为最合适的培育方法进行商业化开发。

RHS2技术的创建是为了利用玉米中天然存在的siRNA介导的RNAi途径生产杂交种子。这些mts-siRNA对玉米具有特异性，但类似的基因表达调节工具可以通过用在其他植物中开发由目标物种的mts-siRNA识别的一种靶基因序列取代。天然siRNA的这种选择性基因调节技术提供了一种用于微调组织、器官或细胞水平的转基因表达以获得所需模式的新方法。

参考文献

Yang H, Qi Y, Goley ME, Huang J, Ivashuta S, Zhang Y, et al. 2018, Endogenous tassel-specific small RNAs-mediated RNA interference enables a novel glyphosate-inducible male sterility system for commercial production of hybrid seed in Zea mays L. PLoS ONE 13(8): e0202921.