单颗粒冷冻电镜技术获得的分子量最小的28kDa RNA结构

撰文 | Leon
责编 | 雪月

许多SARS-CoV-2蛋白的三维结构都已经被解析，大大促进了COVID-19靶向药物的研发。然而，我们对SARS-CoV-2的一些RNA元件的认识还远远不够。Open reading frames (ORF) 1a和ORF 1b的表达量对于SARS-CoV-2来说至关重要。SARS-CoV-2的一个RNA分子，frameshift stimulation element (FSE)，可以介导翻译过程中核糖体的移码，使其越过ORF 1a的终止密码子，开始翻译ORF 1b，这样做可以维持两者表达量的平衡【1-4】。FSE的三维结构尚不清楚，作用的分子机制也不明确，阻碍了靶向药物的研发进程。

2020年7月20日，斯坦福大学的赵华（Wah Chiu）院士和Rhiju Das实验室再次合作，在BioRxiv预印本网站上上传了题为Cryo-electron Microscopy and Exploratory Antisense Targeting of the 28-kDa Frameshift Stimulation Element from the SARS-CoV-2 RNA Genome的论文，共同一作为张凯铭博士，Ivan Zheludev和Rachel Hagey。作者用他们最新开发的Ribosolve工具（详情请见 BioArt 报道：Nat Methods ：RiboSolve 快速解析 RNA 冷冻电镜结构 ） ，用冷冻电镜解析了大小仅为28kDa（88nt）的FSE结构，分辨率约5.9 。这也是人们用单颗粒冷冻电镜技术获得的分子量最小的亚纳米级分辨率结构。

首先，实验者设计了靶向FSE的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO），并在体外和细胞内水平验证了其抗病毒活性。在体外，ASO确实可以抑制SARS-CoV-2 FSE介导的核糖体移码。然而，在亚微摩尔浓度下，ASO只能降低病毒在细胞内的复制，并不能完全抑制其活性。这促使研究人员去分析FSE的三维结构，以寻找更好的靶向FSE的方法。

此前，科学家曾用冷冻电镜解析了分子量为30 kDa的大分子结构【5】，这个最小分子量的记录看来要被打破了。FSE的分子量只有28 kDa，研究者首先获得了分辨率为6.9 的冷冻电镜结构。然而，这个分辨率不足以分析碱基之间的相互作用。此外，电镜数据的分析过程会过滤掉许多异质性高的构象，从而得到的信息并不完整，而这个缺陷可以由计算机模拟来弥补。作者进一步使用Ribosolve来模拟RNA的三维结构，从而得到分辨率约5.9 的结果（见下图），其中FSE的5’端和stem 2的精确度最低。

FSE的三维结构的复杂性解释了为什么靶向FSE的ASO并不能有效地发挥抑制活性。FSE紧密的双链螺旋区域会阻碍单链ASO的结合，因此实验者需要使用接近微摩尔浓度的ASO才能有效抑制FSE的功能。所以，我们或许需要新的策略来靶向FSE。为了提高抗病毒活性，研究者提出，可以设计药物以靶向那些在各种冠状病毒之间高度保守的区域（Ring，J3/2和Slippery site）。

这项工作研究了SARS-CoV-2基因组里面一个功能非常重要的部件，揭示了其三维结构，描述了其发挥功能的分子机制以及潜在的药物靶向策略。SARS-CoV-2的基因组为30 kb的RNA，里面还有许多类似的具有复杂三维结构的组件，它们的大小与这项研究中的FSE非常接近。冷冻电镜和Ribosolve等工具为研究SARS-CoV-2的RNA提供了可能，作者也希望这些工作能够加快COVID-19新疗法的开发。

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.07.18.209270v1

参考文献

1. Rangan, R., Zheludev, I. N. & Das, R. RNA genome conservation and secondary structure in SARS-CoV-2 and SARS-related viruses: a first look.RNA(2020) doi:10.1261/rna.076141.120.

2. Kelly, J. A. et al. Structural and functional conservation of the programmed -1 ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2).J. Biol. Chem.(2020) doi:10.1074/jbc.AC120.013449.

3. Ahn, D.-G. et al. Interference of ribosomal frameshifting by antisense peptide nucleic acids suppresses SARS coronavirus replication.Antiviral Res.91, 1–10 (2011).

4. Park, S.-J., Kim, Y.-G. & Park, H.-J. Identification of RNA Pseudoknot-Binding Ligand That Inhibits the 1 Ribosomal Frameshifting of SARS-Coronavirus by Structure-Based Virtual Screening.Journal of the American Chemical Society vol.133 10094–10100 (2011).

5. Zhang, K. et al. Structure of the 30 kDa HIV-1 RNA Dimerization Signal by a Hybrid Cryo-EM, NMR, and Molecular Dynamics Approach.Structure26, 490–498.e3 (2018).