Nature新突破 | 新工具实现线粒体内的高效单碱基编辑

撰文 | 木兰之枻

图片引自：https://cen.acs.org/biological-chemistry/gene-editing/New-type-base-editor-works/98/i27

除细胞核内的基因组DNA外，真核生物线粒体也拥有独立的基因组mtDNA（mitochondrial DNA）并可编码多种功能性蛋白。mtDNA呈现出母系遗传特征，相关基因突变会导致多种人类遗传病（常称之为线粒体遗传病）。要研究线粒体基因的功能及线粒体遗传病的致病机制，线粒体靶向的高效基因编辑工具极为必要。研究者曾将线粒体信号肽（MTS）与转录激活因子样效应因子核酸酶（TALENS）及锌指蛋白酶（ZFNs）融合，构建出可清除特定基因型mtDNA的基因编辑工具【1-3】。不过这类策略通常只能诱导mtDNA双链断裂和降解，无法实现mtDNA的单碱基突变，因而难以用于致病点突变的功能研究。此外，目前缺乏合适的策略实现RNA的线粒体转运，因此CRISPR-Cas相关的基因编辑及单碱基编辑技术在mtDNA研究中难以应用。

2020年7月8日，来自美国哈佛大学与麻省理工学院Broad研究所的David R. Liu实验室与华盛顿大学医学院的Joseph D. Mougous实验室合作，在Nature发表题为A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing的论文。文章通过对隶属于脱氨基酶超家族的菌间毒素进行研究，发现一种可介导双链DNA胞苷脱氨基化的菌间毒素DddA。研究者通过改造DddA并将其与TALENs融合，构建出RNA非依赖的胞嘧啶碱基编辑器DdCBEs，可实现mtDNA中目标碱基胞嘧啶向胸腺嘧啶（C-T）的高效特异性转换（图1）。利用该工具，研究者成功的构建出携mtDNA致病点突变的人源细胞模型，这为线粒体疾病的机制研究和治疗探索提供了新武器。

图1 线粒体靶向的单碱基编辑工具DdCBEs原理图

细菌Ⅵ型分泌系统（T6SS）相关的脱氨基酶研究发现，新洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cenocepacia, BCE）编码一种菌间毒素DddA。随后的结构分析、生化和细菌实验指出，DddA核心区DddAtox可在体外和细菌中特异性诱导双链DNA的胞苷脱氨基化并表现出5’-TC的偏好性。

现有单碱基编辑工具中的脱氨基酶特异性催化单链DNA中特定碱基的脱氨基化，因此依赖于CRISPR系统在靶位点诱导的ssDNA环的出现。而DddAtox可直接催化双链DNA的胞苷脱氨基化，或可与TALENs及ZFNs等RNA非依赖的碱基编辑工具融合，从而用于mtDNA的编辑。首先，为降低菌间毒素DddAtox本身的细胞毒性，研究者将其改造并拆分为双组分系统：其任一组分均处于失活状态，只有双组分同时存在且恰当组合时方能发挥胞苷脱氨基酶活性。

研究者进一步将双组分系统与TALENs融合获得TALE-DddAtox胞苷单碱基编辑器，该工具在细胞核和线粒体中均能实现靶位点处的C-T碱基转换。细胞核中的研究发现，N末端融合双拷贝的尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）可明显增强其单碱基编辑效率（效率提高约8倍）；然而在线粒体中，C末端融合单拷贝的UGI方能提高其单碱基编辑效率。经优化，研究者最终获得可实现mtDNA中碱基C-T高效特异性转换的胞苷单碱基编辑器DdCBEs。

之后研究者对DdCBE在线粒体中的编辑效率进行评估，结果发现其对HEK293T细胞mtDNA上的五种基因的单碱基编辑效率可达4.6%-49%。进一步分析指出，不同位点编辑效率的差异与脱氨基酶DdAtox的拆分方式、双组分系统的方向排布、TALE位点的选择及靶位点胞嘧啶的位置等关系密切。之后，研究者还用该工具成功的构建出携mtDNA致病点突变（MT-ND4, m.11922G>A）的细胞模型，发现该突变可明显降低氧化磷酸化速度及线粒体呼吸链复合物I的酶活性，证实了DdCBEs在线粒体遗传病研究中的应用潜力。

最后，研究者还对DdCBEs的脱靶风险进行分析。结果显示该系统在细胞核基因组中并无脱靶风险，其在线粒体中的脱靶风险也相对较低，具有相当高的安全性。其中脱氨基酶DddAtox本身并无明显的脱靶效应，部分位点的脱靶风险偏高或源自TALE结构域的非特异性结合。

总体而言，本研究在特异性靶向双链DNA的胞苷脱氨基酶DddA基础上，通过进一步的改造并将其与TALENs融合，首次构建出线粒体靶向的高效单碱基编辑新工具DdCBEs。DdCBEs的诞生不仅让线粒体基因组的功能研究重现曙光，更是为线粒体疾病的机制探索和治疗研究带来新的希望。

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2477-4

制版人：Kira

参考文献

1. Bacman, S. R. et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.Nat. Med.24, 1696–1700 (2018).

2. Bacman, S. R., Williams, S. L., Pinto, M., Peralta, S. & Moraes, C. T. Specific elimination of mutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by mitoTALENs.Nat. Med.19, 1111–1113 (2013).

3. Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J. & Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing arge-scale deletions or point mutations.EMBO Mol. Med.6, 458–466 (2014).