专家点评 Mol Plant | 基因编辑技术助推第三代作物杂交育种技术发展

编者按

杂种优势利用是提高作物产量的有效途径。杂交种往往比双亲具有更高的产量和更好的抗性。作物杂交种培育依赖于雄性不育系与父本的杂交来生产子代杂交种。因此，作物雄性不育系的培育和维持是杂种优势利用的重要前提。目前生产上使用的作物雄性不育系主要分为稳定的细胞质不育系和不稳定的细胞核不育系两类，不仅其创制过程极为复杂，在生产上也存在很多限制。

2020年7月8日，Molecular Plant在线发表了中国农业科学院谢传晓和李新海研究员领导的研究团队题为“Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology“的研究论文，报道了基于基因编辑技术发展了新一代作物不育系和杂交种培育的简易方法。鉴于该研究具有重要的生产应用价值，我们有幸邀请到中科院遗传所高彩霞研究员与华南农业大学王海洋教授对该论文研究工作分别做了点评与详细解读，以飨读者！

专家点评

基因编辑技术助推第三代作物杂交育种技术发展

高彩霞（中国科学院遗传与发育生物学研究所）

杂交种是作物杂种优势利用应用到农业生产上的品种类型。杂交种生产上需要双亲（或多亲）杂交，避免亲本自交成为种子生产环节必须解决的核心问题，雄性不育系应用是解决该问题的重要途径。因此，作物雄性不育是作物杂种优势利用的关键技术，具有重要的意义与价值。

现代农业发展史上作物雄性不育技术的每一次进步都对农业生产做出了巨大贡献。以水稻为例，基于细胞质雄性不育系发展而来的第一代“三系法”杂交稻和基于光温敏感雄性核不育系发展而来的“两系法”杂交稻均获得了大面积应用。为克服传统“三系法”恢、保关系的限制和“两系法”受光温等不可控环境因子的影响，随着分子生物学与现代生物技术的发展，培育基于隐性核不育基因的第三代作物杂交育种技术应运而生。然而，已有的第三代杂交种技术需将隐性核不育突变位点回交导入到不同背景中创制不育系，并需在此基础之上为不育系提供生物技术元件，以实现不育系与保持系的繁殖和分拣。整个过程耗时长，步骤复杂。当前日新月异发展的新兴生物技术，如基因编辑技术为解决这一问题提供了新的技术途径

中国农业科学院研究人员利用基因编辑实现了一步法创制雄性核不育系并筛选得到配套的保持系，该研究利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑定点删除了玉米内源MS26基因重要功能域，创制了ms26ΔE5隐性不育系，该编辑活性不影响同时提供的保持系所需的MS26基因的互补表达盒，并实现了保持系生物技术元件半合子遗传及其与不育系种子的荧光分拣。该技术可以拓展应用于其他杂交种作物中具有产业应用价值的细胞核育性基因种子产业化，为第三代作物杂交种技术提供了高效的解决方案，将助推第三代作物杂交育种技术的发展和产业化应用。该研究是利用基因编辑技术为农作物育种领域传统途径无法克服问题提供有效解决方案的又一个案例。

论文解读

王海洋（华南农业大学）

雄性不育是作物杂种优势利用的关键，根据育性基因的来源分为细胞质雄性不育 (CMS)以及细胞核雄性不育(GMS)两类[1]。上个世纪70年代，基于CMS发展而来的第一代杂交水稻育种技术成功实现了不育系、保持系与恢复系“三系”配套，并在生产上得到了大规模应用。但是第一代杂交水稻育种技术受制于严格的恢、保关系的制约，不仅培育过程复杂，而且资源利用效率低下。

上个世纪90年代，水稻育种家们成功开发出了利用光、温敏感的细胞核雄性不育系(GMS)和父本杂交生产杂交种的“两系法，被称为第二代杂交水稻育种技术。“两系法”克服了第一代CMS技术对恢复系的限制，也取得了大规模应用。但是“两系法”因受到光温等不可控环境因子的影响，生产上存在一定的风险[2]。

近年来随着现代分子生物学的发展，科学家们提出了利用隐性核不育基因创制稳定的核不育系的设想，即通过把两个连锁的育性恢复基因和花粉失活基因通过转基因手段转入到一个隐性雄性不育背景中，从而创制一个转基因雄性保持系。转基因雄性保持系自交后可以产生一半转基因雄性保持系种子和一半不含转基因的不育系种子 [3]。在此基础上，后人进一步提出了利用一个种子荧光标记基因可以实现不育系和转基因保持系的分选 [4]。2006年美国杜邦公司率先在玉米上成功开发了该技术，称之为种子生产技术 （Seed Production Technology, SPT）[5]，随后我国科学家们很快在水稻和玉米上开发出了类似的技术系统 [6,7,8]。这些技术都需要筛选合适的自然GMS不育系，并将其突变基因通过多代回交导入到其他杂交种生产的母本背景中，并在此基础上再通过转基因手段把导入保持系需要的多个生物技术元件，步骤多而繁琐，进程慢。近日，中国农业科学院科研人员利用基因编辑技术实现了一步法创制核不育系与为该不育系配套的保持系的技术，为第三代作物杂交育种技术提供了高效的技术方案。

2020年7月8日，Molecular Plant在线发表了中国农业科学院题为Genome Editing Enables Next-Generation Hybrid Seed Production Technology的研究论文，报道利用基因编辑技术一步法同时创制作物隐性核不育系（GMS）与操控型核不育性保持系（MGM保持系）的技术体系。在该技术体系中，MGM保持系可同时生产GMS不育系与MGM保持系自身，从而实现了不依赖于自然GMS不育系的作物第三代杂交育种技术。

图1.MGM保持系创制及其新一代杂交种生产技术原理示意图

研究人员首先构建与共转化了MS26ΔE5-Editor和MGM两个表达载体（图1A、B），其中，MS26ΔE5-Editor为具有基因编辑活性的CRISPR/Cas9表达载体，转化的MS26ΔE5-Editor可对玉米内源细胞核基因组编码的雄花育性基因MS26进行定点编辑，两个定点DNA断裂位点分别位于4号内含子与非翻译区（3’UTR），从而删除了该基因的第5号外显子，该外显子中包括了决定雄花育性功能的细胞色素P450类血红素结合结构域，从而创制出隐性核基因ms26ΔE5的GMS突变体；共转化的MGM中包含了MS26育性恢复基因、导致雄配子失活的降解花粉淀粉体的淀粉酶基因、籽粒胚乳糊粉层特异红色荧光基因3个串联表达盒。其中，MGM中MS26育性互补表达盒采用MS26 内源自身启动子与MS26-CDS序列，从而保证了MS26ΔE5-Editor基因删除定点编辑机制对MGM上携带的MS26育性互补表达框编码序列的没有编辑活性，两者兼容。再在被MS26ΔE5-Editor成功编辑得到内源ms26ΔE5目标突变的GMS突变系基础上，筛选MS26ΔE5-Editor已被成功分离掉，但携带MGM载体的阳性植株，在进一步鉴定MGM元件为单拷贝半合子的基础之上，创制了MGM保持系。

图2. MGM保持系繁殖的不育系开花期性状（A）与结实籽粒实现了保持系与不育系种子无损分拣（B，C和D）与世代繁殖

MGM保持系上MS26-CDS表达盒赋予了植株具有孢子体雄花育性完全回复的表型；同时，50%单倍体雄配子体中携带MGM元件，MGM元件中的花粉失活表达盒为花粉特异（PG47启动子）驱动的花粉淀粉体导肽定向的alpha淀粉酶（ZmAA1），该酶水解了雄配子细胞(花粉)中淀粉体中的淀粉，从而耗竭了这部分雄配子体能量供应，致使这50%雄配子体彻底失活并失去育性，该活性使MGM元件仅能通过雌配子体向后代遗传，形成MGM遗传元件半合子（hemizygous）孢子体。因此，MGM保持系只可产生一半可育的花粉，该花粉不携带MGM元件（图2A）；此外，MGM还携有一个籽粒糊粉层细胞（Aleurone cell）特异表达的红色荧光蛋白标签(DsRED)，致使保持系中通过雌配子产生的携带MGM的半合子种子带有红色荧光。因此，这个MGM保持系孢子体植株自交结实籽粒会产生一半的携带MGM元件的半合子保持系，这部分种子显红色荧光；另一半种子不携带MGM元件，为GMS不育系种子（图2B），保持系自交产生的种子可分拣为带红色荧光的MGM保持系种子与无荧光的GMS不育系种子。研究还表明这种种子分拣信号可被肉眼与荧光分拣机器识别(图2 C，D)，从而实现保持系与不育系种子的无损伤分拣；分拣得到的GMS不育系可用于杂交种制种生产，MGM保持系种子用于下一个生产年份的保持系和不育系的繁殖，如此反复，形成高效的第三代杂交种制种生产技术。

综上所述，该技术大大提高了培育第三代作物杂交种的研发效率，可以高效地把目标杂交种的母本转变成MGM保持系，然后应用于杂交种制种与亲本繁殖。同样的技术策略可以延伸用于其他细胞核育性基因和其他作物的杂交种生产。通过该技术体系生产的不育系和杂交种将不含有转基因，是利用基因编辑技术快速进行农作物杂交育种的一个简单、有效途径。

参考文献：

1. 袁隆平. 水稻的雄性不孕性.科学通报,1966,17:185-188.

2. 袁隆平. 两系法杂交水稻研究的进展.中国农业科学,1990(03):1-6.

3. Williams M, Leemans J. Maintenance of male-sterile plants. WO Patent Application 1993;WO1993025695A1.

4. Perez-Prat E, van Lookeren Campagne MM. Hybrid seed production and the challenge of propagating male-sterile plants. Trends Plant Sci 2002;7:199–203.

5. Albertsen, M C., et al. Nucleotide Sequences Mediating Male Fertility and Method of Using Same. WO2007002267 2006.

6. Wang, H. and Deng, XW. Development of the “Third-Generation” Hybrid Rice in China. Genomics Proteomics Bioinformatics 16 (2018) 393–396

7. Chang, Z., Chen, Z., Wang, N., Xie, G., Lu, J., Yan, W., Zhou, J., Tang, X., and Deng, X. W. (2016). Construction of a male sterility system for hybrid rice breeding and seed production using a nuclear male sterility gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113:14145–14150.

8. Zhang, D., Wu, S., An, X., Xie, K., Dong, Z., Zhou, Y., Xu, L., Fang, W., Liu, S., Liu, S., et al. (2018). Construction of a multicontrol sterility system for a maize male-sterile line and hybrid seed production based on the ZmMs7 gene encoding a PHD-finger transcription factor. Plant Biotechnol. J. 16:459–471.

https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.06.003