近期，国际顶级期刊“Cell Host & Microbe”发表了来自上海复旦大学、美国洛克菲勒大学、四川大学华西医学院以及美国威尔康奈尔医学院（按文章排序）合作的文章“A Combination of Human Broadly Neutralizing Antibodies against Hepatitis B Virus HBsAg with Distinct Epitopes Suppresses Escape Mutations”，该论文基于荷载乙型肝炎病毒感染的人源肝脏小鼠模型/人源化小鼠模型上，结合结构生物学精细阐述乙型肝炎病毒抗原多表位广泛中和抗体/互补型抗体联用对于难治愈型慢性人肝炎病毒逃逸突变的抑制作用。
背景介绍
尽管存在有效的疫苗，但乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是全球主要的健康问题。目前全球约有2.57亿人感染乙型肝炎病毒。其中，有95％的成年人和50％至75％的1-5岁儿童可自发控制HBV感染，但由于缺乏健全的免疫防护系统，只有10％的婴儿能够自然恢复，其余的则发展为慢性感染，可导致肝硬化和肝细胞癌。尽管抗病毒药物可以抑制慢性感染，但尚无有效的治疗方法可以完全抑制乙肝病毒的扩散。
HBV是一种有包膜的双链DNA病毒，它的基因组是人类致病性DNA病毒中最小的基因组，只有四个开放阅读框。感染肝细胞后会同时产生感染性乙肝病毒颗粒（Dane颗粒）和非感染性亚病毒颗粒（Australia抗原）。病毒体是直径为42 nm的颗粒，包含病毒基因组和被乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的脂膜包裹的HBV核心抗原（HBcAg），而亚病毒颗粒缺乏病毒基因组。HBV表面蛋白既HBsAg具有4个推定的跨膜结构域，可以细分为PreS1，PreS2和S区。S结构域是富含半胱氨酸的蛋白质，由226个氨基酸组成，包含所有4个跨膜结构域。
在HBV的感染模型中，目前比较成熟的一般有人类，黑猩猩，树鼩和人类肝脏嵌合体小鼠模型，使得肝炎病毒的研究更加难以向前推进。
实验开展
为了选择对HBsAg的反应出色的抗体个体，科研人员对159名志愿者的血清进行了ELISA分析。其中包括15个未感染和未接种疫苗的对照（HBsAg，抗HBs和抗HBc全阴性），20个已感染并自发恢复的个体（HBsAg阴，抗HBs + /-和抗HBc +）和124个已接种疫苗（HBsAg -，抗HBs + /-和抗HBc -）的志愿者。这些个体显示出广谱的抗HBs滴度。为了确定其中和活性，我们测试了其在牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）过表达的HepG2细胞中阻断HBV感染的能力。然后从具有高水平中和活性的个体中纯化的血清或抗体进行了较宽稀释范围的比较。
科研人员进一步纯化了S蛋白结合类切换的记忆B细胞，以表征所选个体中具有特殊中和活性的抗体。未接触过的nave对照组和低效价抗HBs（ELISA检测）的疫苗接种个体显示出S蛋白特异性记忆B细胞的背景水平。相反，具有高中和活性的个体显示出独特的S抗原结合B细胞群。
依据抗原表位原理--所选抗体是与重叠表位还是非重叠表位结合，我们进行了竞争ELISA分析。其中S蛋白先与所选抗体孵育，然后再与第二种生物素化抗体孵育。 至此，科研团队排除了在ELISA中显示弱结合水平的抗体（H002，H012，H013，H014和H018）。竞争ELISA鉴定了三组互斥的单克隆抗体，这表明至少有三组非重叠抗原决定簇在HBsAg上。
在进行体内中和实验前，科研人员首先在体外进行中和验证，利用HepG2-NTCP细胞进行了中和测定，IC50为5 ng/ml。
体内中和实验中，为了确定我们的抗HBs bNAb是否能预防体内感染，我们利用人类肝嵌合Fah / NODRag1 / IL2rgnull（huFNRG）小鼠，并向其注射了阴性对照试剂或H020 （I组）或H007（II组）抗体感染HBV。选择这两种抗体是因为它们与非重叠位点结合并且具有广泛而有效的中和活性。在两个独立实验中，所有六只对照动物均被感染，而用H007或H020进行暴露前预防则具有充分的保护作用。我们得出结论，针对主要病毒表面抗原上不同表位的单一抗HBs bNAb可以预防体内感染。
其次，我们将HBV病毒载量为106–108拷贝/ ml血清的huFNRG小鼠中注入了对照抗体或bNAb H020（I组）或H007，以确定bNAb是否也可以清除已确定的感染。Fah / NODRag1 / IL2rgnull小鼠具有高度的免疫缺陷，并且由于缺乏T和B淋巴细胞而无法进行适应性免疫反应。此外，IL2rgnull突变可阻止细胞因子通过多种受体传递信号，从而导致先天免疫功能不足，包括依赖抗体的细胞毒性。因此，单靠抗体治疗不会消除huFNRG小鼠中106–108 DNA拷贝/ ml的病毒血症。
得益于H020（I组）或H007（II组）单药治疗的所有三只小鼠都产生了在S蛋白中带有G145R突变的病毒。这种突变代表了人类的主要免疫逃逸突变。此外，还可以在维持低水平病毒血症的小鼠中鉴定出S蛋白中同一位置的突变。但是 在对照动物中没有。这些结果表明，抗HBs bNAb单一疗法导致出现逃逸突变，该突变与体外bNAb结合特性一致。
结论
综上，单个bNAb可以保护人源化小鼠免于感染，也可以选择其用于预先感染的小鼠中的抗性突变。相比之下，感染是通过靶向非重叠表位的bNAb组合来控制的，这些bNAb对人类感染期间常见的突变具有互补的敏感性。结构生物学的近原子分辨率复杂关系表明，HBsAg肽表位与bNAb的晶体结构显示出稳定的发夹环。这种结构包含在临床免疫逃逸突变体中经常突变的残基，为HBV感染进行免疫治疗可能需要组合互补bNAb的方式提供了分子解释。
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