【中科课堂】猪细小病毒病的检测诊断技术

　　猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。母猪在怀孕前期感染细小病毒，可引起胚胎或胎儿的感染和死亡，导致母猪流产、死胎、木乃伊胎及产出病弱仔猪，母猪本身一般没有明显症状。但可能会引起母猪子宫内膜轻度的炎症，胎盘部分钙化等。感染的胎儿表现不同程度的发育障碍和生长不良，剖检可见胎儿充血、出血和水肿、体腔积液及坏死等。但是仅凭这些症状很难对该病做出准确判断，临床上常与其他疾病相混淆，确诊必须依赖于实验室检测分析。

　　1

　　现行检测诊断标准

　　表1 猪细小病毒病检测诊断标准（现行）

　　序号

　　标准名称

　　实施日期

　　发布部门

　　1

　　SN/T 1919-2016猪细小病毒病检疫技术规范

　　2017-12-01

　　国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会

　　2

　　NY_T2840-2015猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法

　　2015-12-01

　　中华人民共和国农业部

　　3

　　DB51T665-2007猪细小病毒病防治技术规范

　　2007-05-01

　　四川省质量技术监督局

　　2

　　检测诊断方法

　　表2 猪细小病毒病诊断标准中的实验室检测方法

　　检测方法

　　SN/T 1919-2016猪细小病毒病检疫技术规范

　　NY_T2840-2015猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法

　　DB51T665-2007猪细小病毒病防治技术规范

　　病毒分离

　　√

　　血凝抑制试验

　　√

　　酶联免疫吸附试验

　　√

　　√

　　聚合酶链式反应

　　√

　　√

　　荧光定量PCR

　　√

　　2.1

　　病毒分离

　　2.1.1 样品的处理

　　无菌采集初产母猪的流产胎儿、木乃伊胎的内脏，如肺、肝、脾、肾、肠系膜淋巴结，去掉表面的筋膜，剪碎，制成1:10的悬液，加入1%青、链霉素溶液（10000 U/mL），4℃过夜处理。冻融3次，3000 r/min离心10 min，除去细胞碎片，上清液用0.22 μm一次性滤器过滤除菌，滤液置-20℃保存备用。

　　2.1.2 病毒接种

　　取上清液接种PK-15细胞或ST细胞，置37℃吸附1 h，其间每隔15 min摇一次。加入细胞维持液，37℃培养3～6 d，每天观察是否出现细胞病变，同时培养正常细胞作为对照。

　　2.1.3 病毒鉴定

　　若3～6 d内，细胞发生圆缩和溶解，出现弥漫性颗粒样变化，直至细胞破碎，则可认为细胞出现病变，可初判为疑似细小病毒，推荐进一步应用其他病原检测实验证实；如未见细胞病变，盲传3代后，仍无病变可判为细小病毒分离阴性，但仍需进一步应用其他病原检测实验证实。

　　2.2

　　血凝抑制试验

　　2.2.1 检测原理

　　猪细小病毒抗原能凝集豚鼠的红细胞，若被检血清中含有猪细小病毒抗体，则该抗体和抗原结合形成抗原抗体复合物，从而抑制抗原对豚鼠红细胞的凝集作用，红细胞凝集抑制的程度和抗体的量成正比。

　　2.2.2 检测方法及判定

　　实验在96孔V型微量血凝板上进行，第一孔加待检血清25 μL，按2倍稀释度依次稀释血清后，每孔分别再加入25 μL的4单位抗原，震荡混匀后室温作用1 h，每孔分别再加入25 μL 0.5%的红细胞悬液，室温作用1 h，当对照孔红细胞悬液呈显著纽扣状时判定结果。以HA效价≥16lg2 ，且HI效价≥16lg2 判为阳性，否则为阴性。

　　2.3

　　酶联免疫吸附试验

　　选用猪细小病毒抗体ELISA检测试剂盒，严格按照检测试剂盒说明书操作和判断。

　　2.4

　　聚合酶链式反应

　　表3 猪细小病毒PCR检测的引物

　　引物名称

　　引物序列

　　片段大小

　　上游引物P1

　　5’－CAGAATCAGCAACCTCAC－3’

　　445 bp

　　下游引物P2

　　5’－TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG－3’

　　PCR扩增程序：95℃预变形3 min；94℃变形30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸10 min。

　　结果判定：经PCR扩增反应后，在试验有效的前提下，被检样品PCR产物经电泳后仅在445 bp处出现特异性扩增条带者，判为PPV阳性；被检样品PCR产物经电泳后无特异性条带，判为阴性。

　　2.5

　　荧光定量PCR

　　表4 猪细小病毒荧光定量PCR检测的引物

　　引物名称

　　引物序列

　　上游引物P1

　　5’－TCACCAAACAATTAATAATAGC－3’

　　下游引物P2

　　5’－GGTTCATCATCATTATATTGTG－3’

　　探针

　　5’FAM－ACACAGAAGCAACAGCAATTAGGC－3’Eclipse

　　结果判定：被检样品经核酸提取和扩增后，在实验有效的前提下，Ct值小于等于35，且出现特定的扩增曲线判为猪细小病毒阳性；无Ct值且无扩增曲线判为猪细小病毒阴性。Ct值大于35小于40则认为可疑，需重复检测，重复检测结果仍可疑则可认为猪细小病毒阳性。

　　3

　　结语

　　猪细小病毒病的实验室检测方法有多种，各有优缺点。病原检测中，病毒的分离鉴定是最基本的检测方法，但是比较繁琐，耗时较长，不利于快速诊断；HA/HI试验和ELISA对猪细小病毒抗体能起到良好的检测效果，利于随时跟踪检测抗体的消长情况，以便制定合理的免疫程序；PCR和荧光定量PCR都是进行大批量检测抗原的常用方法，但相比之下，荧光定量PCR检测抗原更精确、更快速、更便捷，是净化工作的最佳选择。