代谢组学热门技术早该这么选了！| 课程回顾

华大科技一年一度的春季培训开启全新模式 ——1小时线上课堂，专注解惑，在线回复，更接受量身定制，让老师们疫情防控、课题研究两不误！3月19日晚，华大科技技术支持工程师袁子琛老师带来《代谢组学技术介绍及文章案例解析》，以下是课程精华，供大家参考。

课程回顾

组学的概念最先由基因组学兴起。自1986年，科学家提出基因组学起，转录组学、蛋白质组学、代谢组学的技术又陆续被提出和发展。代谢组学作为组学家族中年轻的一员，研究的是基因组最下游的产物——代谢组，这是指生命体在特定的生理状态下所遗留下的所有小分子化合物，其分子量通常小于1500Da。

通常根据研究对象和研究目的的不同，可将代谢组学分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学两种研究策略。非靶向代谢组学更适用于探索型、发现型实验，分析生物样本中尽可能多的代谢物；而靶向代谢组学则是在已经有了一定的前期研究基础时，对样本中的目标代谢物进行检测及定量。

而根据研究对象的不同，非靶向代谢组学又可以分为常规的非靶向代谢组学和脂质组学。其中常规的非靶向代谢组学的研究对象包含了氨基酸、有机酸、维生素等所有的代谢物。而脂质组学则只研究机体中所有的脂质，这是一类不溶于水的非极性物质。

常规的非靶向代谢组学，研究目的通常是尽可能多地鉴定出目标生物样本中的代谢物，并分析出与表型相关的特征代谢物。在选取了合适的生物样本以后，会使用提取试剂将样本中代谢物提取出来，随后通过色谱技术将这些混合的代谢物按照其理化性质的不同依次洗脱出来，这时疏水性不同的代谢物就具有了不同的保留时间，然后从色谱柱中洗脱出来的代谢物会进入到质谱仪中进行检测，从而采集得到一级质谱以及二级质谱信息。最终通过对下机数据进行鉴定及分析得到与生物表型相关的代谢物的表达谱图。

由于代谢物结构的多样性，目前的（常规）非靶向代谢组学技术仍然存在两个技术难点：代谢物覆盖度不全面，以及代谢物鉴定困难。通常我们可以选择合适的样本提取方案、色谱柱及色谱梯度，并通过质谱正负离子模式同时进行数据采集的模式来尽可能多的提升代谢物的检测覆盖度；对于结构鉴定，也是采取优化色谱方法配合二级高分辨质谱仪检测的策略来提升数据质量，同时建立标准品数据库以提升代谢物鉴定的准确性。

脂质组学是从非靶向代谢组学独立出来的一个分支，主要用于检测和分析脂质这一类化合物在生命体中的组成及含量变化及其对生命活动的影响。脂质在生物体内占了很大比重，它参与细胞膜、细胞骨架等的组成；可以储存能量，参与能量代谢；同时参与信号转导，与生命体发育及生理活动都密切相关。

相较于整体的代谢组，脂质在结构上具有一定的规律性，使得它检测分析起来要稍容易一些。脂质可以分为8大类，每一类都具有相应的结构特征。脂肪酸——由羧基连接的长碳氢链组成；甘油酯——丙三醇的羟基上取代有脂肪酸链；甘油磷脂——丙三醇的其中一个羟基被磷酸酯化，剩余的羟基上则取代有脂肪酸链；鞘脂——由鞘氨醇与脂肪酸酯化而成；糖脂——含有糖基配体的脂类化合物；甾醇酯——一般由甾醇与脂肪酸酯化而成；异戊烯醇酯——具有一个或多个异戊烯单元；聚酮——可分为两类，芳香聚酮及内酯环类聚酮，一般是微生物产生的次级代谢物。

靶向代谢组学主要用于目标代谢物的检测，使用到的平台主要是三重四级杆质谱仪，通过多反应监测技术（MRM）进行检测：代谢物进入质谱以后，只有与给定质荷比一致的母离子能通过第一个四级杆并被检测，在第二个四级杆中目标离子发生碰撞产生子离子碎片，而只有与给定的质荷比一致的子离子能通过第三个四级杆并被检测到，最后检测到的母子离子对的质谱峰与标准曲线比对得到定量值。

以代谢组学为主要分析手段的应用型文章的思路，可以由浅入深地总结为以下几个部分：首先选取相关表型特征的生物样本，通过非靶向代谢组学技术对样本中的代谢表达谱图和差异代谢物进行测定，随后这些差异代谢物需要进行靶向代谢验证和确认，以验证该代谢物确实在样本中存在差异表达，在相关的表型中具有普适性。此时通过代谢组学发现的与表型相关的特征代谢物，可以进行实验逆推出其调控生命活动的具体作用机制，这往往需要配合一系列传统的生物实验进行探索。在这个研究层层递进的过程中，每一步都能得到新的发现和探索，其中一部分成果可以走向实际应用。

课程的最后总结了应用型代谢组学文章通用的三种研究方案。首先可以通过简单的非靶实验鉴定与生物表型相关的代谢谱图，同时通过已知导向未知，进行对新的天然产物的探索；其次可以结合使用非靶向代谢组学与靶向代谢组学技术，探究特殊表型的生物标志物，这通常适用于疾病诊断标志物的筛选；最后可以以代谢组学作为发现型实验，结合传统的生物学实验介导分子通路的探究和验证。这些探索由浅入深，我们可以根据研究目的选择合适的方案进行探索。

此外，以下是课程中分享的案例：

1. 探究生物表型相关的代谢表达谱图：

UPLC‐HRMS‐based untargeted metabolic profiling reveals changes in chickpea (Cicer arietinum) metabolome following long‐term drought stress

DOI: 10.1111/pce.13195

2. 未知代谢物的发现：

Directed Non-targeted Mass Spectrometry and Chemical Networking for Discovery of Eicosanoids and Related Oxylipins

DOI: 10.1016/j.chembiol.2018.11.015

3. 疾病诊断标志物的筛选：

Identification of serum metabolites associating with chronic kidney disease progression and anti-fibrotic effect of 5-methoxytryptophan

DOI: 10.1038/s41467-019-09329-0

4. 代谢物调控生物表型的表达调控途径的探索及验证：

TMAVA, a Metabolite of Intestinal Microbes, Is Increased in Plasma From Patients With Liver Steatosis, Inhibits γ-butyrobetaine Hydroxylase, and Exacerbates Fatty Liver in Mice

DOI: 10.1053/j.gastro.2020.02.033

5. 科研成果走向临床应用案例：

Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression

DOI: 10.1038/nature07762

The role of sarcosine metabolism in prostate cancer progression

DOI: 10.1593/neo.13314

课程答疑

1.不同批次检测的数据，可以合并分析吗？

由于质谱仪的特性，在长时间的数据采集过程中，质谱仪的信号会发生一定的漂移，这使得不同批次检测到的数据很难进行数据校正，目前一般不建议合并分析。

2.为什么做完非靶向代谢组以后还需要做靶向代谢对差异代谢物进行验证？

有两个目的：1）做结构确认，确认代谢物结构鉴定的准确性。即使有代谢物匹配到标准品库被准确鉴定了，仍有许多代谢物鉴定的结果没有使用到MS2或者RT保留时间，所以通过非靶鉴定的结果大多仍需要靶向确认；2）确认差异代谢物在不同表型中的样本中真的存在差异表达。非靶向代谢所得到的定量结果是相对定量，而在进行高通量的代谢物的检测过程中，数据信号可能会受到相互干扰，其相对定量的结果往往只能做大致的参考，确定代谢物的准确表达量仍然需要做靶向定量。

3.差异代谢物的数量太多应该如何选择？

从分析的角度上建议选择差异较大，表达量较高的差异代谢物；同时可以辅以文献调研再挑选可能与研究背景相关的差异代谢物。

4. 收集做代谢的样本保存时间在多久以内比较合适？

收集到的代谢样本经过液氮速冻存入-80°C冰箱，保存期在一年以内较为合适。

对于代谢组学数据分析、多组学联合分析等主题感兴趣的老师，可以继续关注后续的课程。

课程预告

华大科技春季培训还在火热进行中，最新课表请收好了——

（仅供参考，以实际为准）

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